靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒及其制备方法和应用，该重组慢病毒基因组中包含一个Apoptin基因表达盒，Apoptin基因表达盒包含Osterix基因启动子、Apoptin基因和终止子，Apoptin基因的表达由Osterix基因启动子调控；该重组慢病毒以泛成骨细胞特异表达基因Osterix的启动子作为启动元件，在成骨分化细胞中表达诱导成骨分化细胞凋亡的Apoptin，而对成软骨分化细胞和正常软骨细胞不发挥作用，可以制成诱导成骨分化细胞凋亡的药物，对经过成软骨诱导分化处理的种子细胞中残存的成骨分化细胞进行处理，保证种子细胞成软骨分化的单一路径，从而为组织工程软骨的构建提供一种良好的种子细胞；该重组慢病毒的制备方法简便、快速、成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组病毒，特别涉及一种靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒，还涉及该重组慢病毒的制备方法和应用。

背景技术

软骨损伤或缺失是临床上的常见问题，由于软骨的组织学和生物学特性限制了其自身的修复能力，目前尚缺乏有效的治疗措施。组织工程方法为软骨缺损的修复提供了一种全新的手段，利用支架材料为种子细胞的增殖和基质分泌提供空间架构，形成类似正常软骨组织的结构，并行使功能。种子细胞包括胚胎干细胞和多种来源的间充质干细胞如骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞等。由于较易获得和具有诱导成软骨分化潜能，骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)被认为是目前软骨组织工程理想的种子细胞。但在将MSCs与可吸收性支架材料复合构建细胞-材料复合体并进行体外软骨分化诱导培养时，在组织工程软骨中会有碱性磷酸酶和骨钙素阳性细胞出现，而且，组织工程软骨经裸鼠皮下种植或者肌袋种植几个月后，在典型的软骨陷窝样结构中散在出现骨化灶，表明部分种子细胞进入软骨内骨化程序。这种由于种子细胞异质性引起的骨化现象，是目前制约组织工程软骨构建技术的重要瓶颈问题之一，势必影响到软骨的构建和在体缺损的完全修复和功能重建。因此，如何调控MSCs定向分化成软骨细胞并抑制其向成骨细胞分化是目前软骨组织工程学中的重要问题。为获得高效特异的软骨种子细胞，必须对组织工程软骨种子细胞的成骨分化部分进行处理。

在成骨细胞的转录调节中，Osterix(Osx，也称为SP7)基因作为成骨细胞分化和骨形成必需的转录因子日益受到重视。Osterix基因属于Sp/XKLF家族，是一种具有锌指基序结构域的转录因子，位于核心结合因子Cbfa1/Runx2的下游并受其调控，在Osterix基因启动子区(-713～-700bp)存在Cbfa1的识别调控位点。研究发现，Osterix基因敲除小鼠无骨骼形成但具有软骨内骨骼结构，且Cbfa1表达为阳性，而Cbfa1缺陷小鼠不表达Osterix。据此，部分学者提出了成骨细胞分化形成的模式：MSCs分化为能分泌II型胶原的软骨前体细胞→Cbfa1基因启动→细胞向能分泌I型胶原的成骨前体细胞或肥大型软骨细胞转化→Osterix基因启动→成骨前体细胞转化为成骨细胞→成骨细胞分泌骨钙素、骨唾液蛋白及骨连接蛋白等细胞外基质。根据上述模式，表达Cbfa1的细胞仍有潜在双向分化能力，既可分化为成骨细胞，又可分化为软骨细胞，而表达Osterix的细胞具有直接成骨能力。

凋亡素(Apoptin)是一种来源于鸡贫血病毒、由121个氨基酸组成的小蛋白，能诱导雏鸡造血母细胞和T淋巴细胞前体细胞凋亡，导致雏鸡出现严重的贫血和免疫机能低下。Apoptin还可以通过独立于p53作用途径且不被Bcl-2过量表达所抑制的方式诱导人肿瘤细胞和转化细胞凋亡，而对正常细胞不发挥作用。因此，Apoptin被认为是第一个真正意义上可选择性诱导肿瘤细胞和转化细胞凋亡而不损伤正常细胞的凋亡蛋白。研究发现，Apoptin诱导细胞凋亡活性与其亚细胞定位密切相关。在正常细胞中，Apoptin定位于细胞质，不能诱导细胞凋亡；而在肿瘤细胞中，Apoptin定位于细胞核中，能够诱导肿瘤细胞凋亡。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒，可以对经过成软骨诱导分化处理的种子细胞中残存的成骨分化细胞进行处理，诱导成骨分化细胞凋亡而对成软骨分化细胞和正常软骨细胞不发挥作用，保证种子细胞成软骨分化的单一路径，从而为组织工程软骨的构建提供一种良好的种子细胞；目的之二在于提供所述靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒的制备方法；目的之三在于提供所述靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒，所述重组慢病毒基因组中包含一个Apoptin基因表达盒，所述Apoptin基因表达盒包含Osterix基因启动子、Apoptin基因和终止子，所述Apoptin基因的表达由Osterix基因启动子调控。

进一步，所述Apoptin基因表达盒还包括V5表位基因序列，所述V5表位基因序列位于Apoptin基因和终止子之间；

进一步，所述重组慢病毒是将Apoptin基因表达盒插入HIV-1病毒基因组而得到。

2、所述靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒的制备方法，包括以下步骤：

a、Osterix基因启动子片段的克隆：根据Osterix基因启动子片段的核苷酸序列和慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO的引物设计要求设计并合成引物，以小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1的基因组DNA为模板，PCR扩增Osterix基因启动子片段，克隆至pGEM-T载体，得重组载体pGEM-T/Osxp；

b、Apoptin基因片段的克隆：根据Apoptin基因的核苷酸序列设计并合成引物，以鸡法氏囊组织中提取的基因组DNA为模板，PCR扩增Apoptin基因片段，克隆至pGEM-T载体，得重组载体pGEM-T/Apo；自pGEM-T/Apo中用EcoRV和XbaI双酶切出Apoptin基因片段，与同样经EcoRV和XbaI双酶切的pcDNA3.1(+)载体在T4DNA连接酶的作用下连接，得重组载体pcDNA3.1-Apo；

c、Osxp-Apoptin重组慢病毒载体的构建：自pGEM-T/Osxp中用KpnI和EcoRI双酶切出Osxp片段，与同样经KpnI和EcoRI双酶切的pcDNA3.1-Apo在T4DNA连接酶的作用下连接，得重组载体pcDNA3.1-Osxp-Apo；再自pcDNA3.1-Osxp-Apo中用KpnI和XbaI双酶切出Osxp-Apoptin片段，与pLenti6/V5-D-TOPO载体连接，得重组载体pLenti6/V5-Osxp-Apo；

d、Osxp-Apoptin重组慢病毒的包装：采用Lipofectamine 2000试剂将pLenti6/V5-Osxp-Apo以及慢病毒包装质粒混合物共转染293FT细胞，待细胞出现明显病变后，收集含病毒的培养上清液，即得Osxp-Apoptin重组慢病毒。

进一步，步骤a中所述引物序列为：

上游引物：5’-ggggtacccccacccagggaagcaagatgat-3’；

下游引物：5’-cggaattccgggtcccaaggagtcaggcagat-3’；

进一步，步骤a中所述PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟、59℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟；

进一步，步骤b中所述引物序列为：

上游引物：5’-cggatatccgagtaatttcaaatgaacgct-3’；

下游引物：5’-gctctagagccagtcttatacgccttcttgc-3’；

进一步，步骤b中所述PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟、60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共30个循环，最后72℃延伸5分钟。

3、所述靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒在制备诱导成骨分化细胞凋亡的药物中的应用。

本发明的靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒主要由三部分组成：①以泛成骨细胞特异表达基因Osterix的启动子作为启动元件；②在细胞内表达并自杀成骨分化细胞的基因Apoptin；③高感染率和稳定整合性兼顾的慢病毒载体。各部分的选择依据如下：①启动元件的选择：利用特异性启动子调控目的基因在靶细胞中表达是实现靶向性基因治疗的重要手段。Osterix在成骨细胞中特异性表达，一方面，Osterix可以使表达Cbfa1的成骨前体细胞定向分化为成骨细胞，在软骨内成骨过程中具有分离成骨细胞系和软骨细胞系的作用；另一方面，Osterix是Sox9(在软骨细胞和软骨组织分化中具有重要作用)表达和软骨细胞表型的负调节因子；这些均使Osterix基因启动子成为驱动自杀基因表达的理想启动元件；②自杀基因的选择：Apoptin基因是一个较佳的自杀基因，外源性Apoptin表达后，在靶细胞中逐渐发生核转位，而在正常细胞中则滞留在细胞质中，即使Apoptin表达于正常细胞的细胞核中，也不会诱导细胞凋亡。在Osterix基因启动子的引导下，Apoptin可以特异性地杀伤成骨分化细胞，而不会伤及成软骨分化细胞及正常软骨细胞。③外源基因导入载体的选择：非病毒学的基因转移方法效率较低，已用于人体试验的基因治疗方案绝大多数是以病毒学方法进行基因转移的，其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为成熟。理想的病毒载体应能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物安全性。逆转录病毒载体虽可使目的基因整合至靶细胞基因组实现稳定表达，但只能转导分裂期细胞，不能转导非分裂期细胞。腺病毒载体虽能转导分裂期细胞和静止期细胞，转导效率也较高，但目的基因不整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，而且腺病毒蛋白可引起人体免疫反应及炎症反应。慢病毒载体因其具有可感染非分裂期细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，有望成为理想的基因转移载体。常用的以1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)为基础构建的慢病毒载体是把HIV-1基因中与病毒包装、逆转录和整合有关的顺式作用元件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别改造成载体成分和包装成分，通常将包装成分分别独立放置在2个质粒上(包装质粒和包膜质粒)。现在使用的慢病毒载体大多是四质粒系统，包括载体质粒、包装质粒、包膜质粒和pVSV-G质粒，以VSV-G(疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因)取代HIV的Env基因，产生的假HIV病毒颗粒安全性高、宿主细胞广、稳定性强、滴度高。

本发明的有益效果在于：针对目前在组织工程软骨构建中由于种子细胞中残存成骨分化细胞引起骨化灶形成的难题，本发明建立了一种靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒，以泛成骨细胞特异表达基因Osterix的启动子作为启动元件，在成骨分化细胞中表达诱导成骨分化细胞凋亡的Apoptin，而对成软骨分化细胞和正常软骨细胞不发挥作用，可以制成诱导成骨分化细胞凋亡的药物，对经过成软骨诱导分化处理的种子细胞(包括胚胎干细胞和多种来源的间充质干细胞如骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞等)中残存的成骨分化细胞进行处理，保证种子细胞成软骨分化的单一路径，从而为组织工程软骨的构建提供一种良好的种子细胞。该重组慢病毒的制备方法简便、快速、成本低。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为Osterix基因启动子调控Apoptin基因(Osxp-Apoptin)重组慢病毒的构建示意图；

图2为PCR扩增Osterix基因启动子(Osxp)片段的琼脂糖凝胶电泳结果，其中泳道1为DNA分子量标准，泳道2和3为Osxp片段的PCR产物；

图3为经Osxp-Apoptin重组慢病毒处理的骨骺软骨细胞的阿尔辛蓝染色结果；

图4为经Osxp-Apoptin重组慢病毒处理的骨骺软骨细胞增殖实验结果；

图5为经Osxp-Apoptin重组慢病毒处理的MSCs的II型胶原免疫荧光染色结果；

图6为经Osxp-Apoptin重组慢病毒处理的MSCs成软骨分化的阿尔辛蓝染色结果；

图7为经Osxp-Apoptin重组慢病毒处理的MSCs成软骨分化的碱性磷酸酶染色结果；

图8为在体观察Osxp-Apoptin重组慢病毒对软骨形成的影响。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除另有说明外，优选实施例中的各种限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶和试剂盒等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司。

一、Osxp-Apoptin重组慢病毒的制备

Osxp-Apoptin重组慢病毒的构建示意图如图1所示，其制备方法包括以下步骤：

1、Osxp片段的克隆

根据GenBank NT_039621.7中Osxp片段的核苷酸序列和慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO的引物设计要求，设计并合成如下引物：

F1：5’-ggggtacccccagggaagcaagatgat-3’(SEQ ID No.1)，下划线部分为限制性内切酶KpnI酶切位点，粗斜体部分为拓扑异构酶(TOPO)连接位点；

R1：5’-cggaattccgggtcccaaggagtcaggcagat-3’(SEQ ID No.2)，下划线部分为限制性内切酶EcoRI酶切位点。

采用基因组DNA提取试剂盒从小鼠胚胎成骨细胞株MC3T3-E1中提取基因组DNA，按照试剂盒说明书操作。

以MC3T3-E1细胞基因组DNA为模板，以F1和R1为上下游引物，采用PCR试剂盒扩增Osxp片段，按照试剂盒说明书操作。PCR扩增体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTPs 5μL，上下游引物各2μL，模板4μL，MgCl₂4μL，Taq DNA聚合酶1μL，用无DNA酶水稀释至总体积50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟、59℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见PCR产物在约2.1kb处出现特异性条带(如图2所示)，与目标片段的分子量大小一致。采用PCR产物回收试剂盒切胶回收纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。

将纯化后的PCR产物与克隆载体pGEM-T(Promega公司)在T4DNA连接酶的作用下连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，抽提质粒，进行测序鉴定，结果显示，所得阳性克隆质粒中插入片段的序列(SEQ ID No.3)与Osxp片段的序列一致，将其命名为pGEM-T/Osxp。

2、Apoptin基因片段的克隆

根据GenBank AF313470中Apoptin基因的核苷酸序列，设计并合成如下引物：

F2：5’-cggatatccgagtaatttcaaatgaacgct-3’(SEQ ID No.4)，下划线部分为限制性内切酶EcoRV酶切位点；

R2：5’-gctctagagccagtcttatacgccttcttgc-3’(SEQ ID No.5)，下划线部分为限制性内切酶XbaI酶切位；为了作Apoptin同V5表位的融合表达，在3′端删除了终止子。

将鸡颈静脉放血处死，立即分离法氏囊，采用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，按照试剂盒说明书操作。

以鸡法氏囊组织中提取的基因组DNA为模板，以F2和R2为上下游引物，采用PCR试剂盒扩增Apoptin基因片段，按照试剂盒说明书操作。PCR扩增体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTPs 5μL，上下游引物各2μL，模板4μL，MgCl₂4μL，Taq DNA聚合酶1μL，用无DNA酶水稀释至总体积50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟、60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共30个循环，最后72℃延伸5分钟。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，可见PCR产物在约0.4kb处出现特异性条带，与目标片段的分子量大小一致。采用PCR产物回收试剂盒切胶回收纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。

将纯化后的PCR产物与克隆载体pGEM-T(Promega公司)在T4DNA连接酶的作用下连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，抽提质粒，进行测序鉴定，结果显示，所得阳性克隆质粒中插入片段的序列(SEQ ID No.6)与Apoptin基因片段的序列一致，将其命名为pGEM-T/Apo。

自阳性克隆质粒pGEM-T/Apo中用EcoRV和XbaI双酶切出Apoptin基因片段，与同样经EcoRV和XbaI双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)在T4DNA连接酶的作用下连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，抽提质粒，进行EcoRV和XbaI双酶切鉴定及测序鉴定，测序结果显示，所得阳性克隆质粒中插入片段的序列与Apoptin基因片段的序列一致，将其命名为pcDNA3.1-Apo。

3、Osxp-Apoptin重组慢病毒载体的构建

自阳性克隆质粒pGEM-T/Osxp中用KpnI和EcoRI双酶切出Osxp片段，再与同样经KpnI和EcoRI双酶切的阳性克隆质粒pcDNA3.1-Apo在T4DNA连接酶的作用下连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，抽提质粒，进行KpnI和EcoRI双酶切鉴定及测序鉴定，测序结果显示，所得阳性克隆质粒中Osxp片段定向插入至Apoptin基因片段上游，将其命名为pcDNA3.1-Osxp-Apo。

自阳性克隆质粒pcDNA3.1-Osxp-Apo中用KpnI和XbaI双酶切出Osxp-Apoptin片段，与慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO(Invitrogen公司)按体积比为1∶1混合，加入6×连接缓冲液(Invitrogen公司)1μL，用灭菌蒸馏水补充至总体积6μL，温度22℃孵育5分钟，使Osxp-Apoptin片段和慢病毒载体连接；连接产物转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，挑取单菌落扩增，取菌液进行PCR鉴定，同时抽提质粒进行测序鉴定，测序结果显示，所得阳性克隆质粒中插入片段的序列与预期序列完全相符，将其命名为pLenti6/V5-Osxp-Apo。

4、Osxp-Apoptin重组慢病毒的包装

将3μg阳性克隆质粒pLenti6/V5-Osxp-Apo和9μg慢病毒包装质粒混合物溶于1.5mL无血清Opti-MEMI培养基中，命名为A液；将36μL Lipofectamine 2000稀释于1.5mL无血清Opti-MEMI培养基中，命名为B液；将A液和B液混匀，室温孵育20分钟使形成DNA-脂质体复合物；将DNA-脂质体复合物转移至含有5mL Opti-MEMI生长培养基和血清的培养皿中，加入含有6×10⁶个细胞的293FT细胞悬液，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养，6小时后将培养基更换为5mL含有浓度为1mmol/L的丙酮酸钠和体积分数为10％的胎牛血清的DMEM培养基，2天后可见细胞发生病变，表现为贴壁细胞变圆，3天后可见圆形细胞呈葡萄串状丛集分布于正常的293FT细胞上，出现病毒空斑，收集含病毒的培养上清液，温度4℃、3000r/min离心15分钟，收集上清液，用孔径为0.45μm的滤膜过滤，即得Osxp-Apoptin重组慢病毒悬液，温度-80℃冻存，备用。

在6孔培养板中培养MC3T3-E1细胞，待细胞达50％融合时，加入不同稀释度(10^-7～10^-2)的Osxp-Apoptin重组慢病毒悬液，以及终浓度为6μg/mL的聚凝胺(polybrene)和终浓度为4.0μg/mL的杀稻瘟素(blasticidin)，筛选感染细胞，经10～12天，所得杀稻瘟素抗性集落用PBS漂洗2次，加入1mL质量分数为1％的结晶紫染色液，室温放置10分钟，再用PBS漂洗2次，计算蓝染克隆，测得Osxp-Apoptin重组慢病毒的滴度为2～5×10⁶TU/mL。

以所得Osxp-Apoptin重组慢病毒的基因组DNA为模板，以F3和R3为上下游引物[F3：5’-actccgagtcaagagtaggattgtagg-3’(SEQ ID No.7)；R3：5’-agaatgggagaa tgggagagaag-3’(SEQ ID No.8)]PCR扩增Osxp片段，以F4和R4为上下游引物[F4：5’-atctgcaactgcggacaa-3’(SEQ ID No.9)；R4：5’-gctgggagtagtggtaatcaa-3’(SEQ ID No.10)]PCR扩增Apo片段，结果显示，采用上述引物可以扩增出565bp的Osxp片段和157bp的Apo片段。

取1×10⁶个经Osxp-Apoptin重组慢病毒感染24小时后的C3H10T1/2细胞，用温度4℃预冷的PBS洗涤1次，再用1ml质量分数为4％的多聚甲醛室温固定40分钟，用PBS洗涤1次，再用1ml含有体积分数为5％的人血清的PBS重悬细胞，冰上孵育10分钟，800rpm离心5分钟，弃上清，加入200μl含有质量分数为0.5％的牛血清白蛋白和饱和剂量的FITC标记的抗V5表位抗体(Invitrogen公司)的PBS，冰上避光放置30分钟，离心弃上清，再加入200μl质量分数为1％的多聚甲醛固定，用流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。结果显示，当感染复数(MOI)＝10时，85％以上的C3H10T1/2细胞表达Apoptin；当MOI＝40时，几乎所有C3H10T1/2细胞均表达Apoptin。

二、Osxp-Apoptin重组慢病毒靶向诱导成骨分化细胞凋亡能力的检测

1、对软骨细胞的影响

将新生1周的SD大鼠脱颈处死，无菌条件下切取双侧髋膝关节软骨，用DMEM培养基漂洗2次，剪成1mm×1mm大小，加入浓度为0.3U/mL的胶原酶溶液，温度37℃消化4小时，吹打成单细胞悬液，150目不锈钢滤网过滤，滤液1000r/min离心5分钟，弃去上清液，用含有体积分数为10％的胎牛血清、浓度为100U/mL的青霉素和浓度为100U/mL的链霉素的DMEM培养基重悬细胞，以细胞密度为10⁵个/mL接种于培养瓶中，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养，48小时后视细胞贴壁情况更换新鲜培养基，以后每2～3天更换1次新鲜培养基，当在倒置显微镜下观察到软骨细胞汇合成片长满大部分培养瓶壁后，弃去培养基，加入质量分数为0.25％的胰蛋白酶溶液和质量分数为0.02％的乙二胺四乙酸溶液进行消化传代，将5×10⁵个软骨细胞传代入24孔板，待细胞融合达50％时，按MOI＝40感染Osxp-Apoptin重组慢病毒并加入终浓度为8mg/L的聚凝胺，感染后24小时更换为含有体积分数为10％的胎牛血清、浓度为100U/mL的青霉素和浓度为100U/mL的链霉素的DMEM培养基，感染后72小时将细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔培养板，次日丰度达90％后，按MOI＝40感染Osxp-Apoptin重组慢病毒，感染后24小时更换为含有体积分数为10％的胎牛血清、浓度为100U/mL的青霉素和浓度为100U/mL的链霉素的DMEM培养基，感染后72小时进行细胞增殖实验(WST-8染色法)，同时进行软骨细胞的阿尔辛蓝染色观察基质蛋白多糖含量。

结果：经Osxp-Apoptin重组慢病毒处理的骨骺软骨细胞，阿尔辛蓝染色可见大量阳性染色细胞存在(图3)。经Osxp-Apoptin重组慢病毒处理的骨骺软骨细胞与空病毒处理细胞和正常软骨细胞相比，三者的增殖和存活率无明显差异(P＞0.05)(图4)，表明Osxp-Apoptin重组慢病毒对软骨细胞具有规避作用。

2、对间充质干细胞成软骨分化的影响

取1月龄小鼠双下肢长骨，充分冲洗骨髓腔，将冲洗液与淋巴细胞分离液以体积比为5∶3混匀，1500r/min离心30分钟，吸取单核细胞层，用含有体积分数为10％的胎牛血清、浓度为100U/mL的青霉素和浓度为100U/mL的链霉素的低糖DMEM培养基进行原代培养，每3天更换1次新鲜培养基，12天后进行第1次传代，之后每3～5天传代1次，取第三代MSCs，调整细胞密度为5.0×10⁵个/cm²，按MOI＝40感染Osxp-Apoptin重组慢病毒并加入终浓度为8mg/L的聚凝胺，感染后24小时更换为含有体积分数为10％的胎牛血清、浓度为100U/mL的青霉素和浓度为100U/mL的链霉素的DMEM培养基，感染后48小时进行成软骨诱导分化：加入无血清软骨诱导液(含有浓度为10ng/mL的转化生长因子β1、浓度为0.1μmol/L的地塞米松、浓度为50μg/mL的抗坏血酸和1×ITS+1)进行单层细胞诱导培养，分别于诱导后7天和14天进行细胞增殖实验(WST-8染色法)、II型胶原检测(SP法)、阿尔辛蓝染色以及碱性磷酸酶染色，同时采用流式细胞术检测MSCs成软骨分化效率。

结果：经Osxp-Apoptin重组慢病毒处理的MSCs增殖正常，II型胶原表达正常(图5)，阿尔辛蓝染色正常(图6)，未见碱性磷酸酶阳性细胞存在(图7)，表明Osxp-Apoptin重组慢病毒对MSCs成软骨分化具有较好的规避作用。流式细胞术检测Osxp-Apoptin重组慢病毒处理的MSCs成软骨分化效率高达85％。

3、对成骨细胞的影响

取24小时内胎鼠头盖骨，在PBS中去除血液和周围结缔组织，用剪刀剪成泥状，加入质量分数为0.25％的胰蛋白酶溶液，温度37℃消化30分钟，吸弃胰蛋白酶溶液，用PBS洗涤1次，再加入浓度为0.3U/mL的胶原酶溶液，温度37℃振荡消化1小时，吸弃胶原酶溶液，再加入DMEM培养基，反复吹打骨片使细胞从骨片上脱落下来，所得细胞悬液接种于培养瓶中，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下培养，24小时后更换新鲜培养基，之后每48小时更换1次新鲜培养基，待原代成骨细胞融合达60％时，按MOI＝40感染Osxp-Apoptin重组慢病毒并加入终浓度为8mg/L的聚凝胺，感染后24小时更换为含有体积分数为10％的胎牛血清、浓度为100U/mL的青霉素和浓度为100U/mL的链霉素的DMEM培养基，分别于感染后24小时和48小时收集细胞，提取总RNA，采用RT-PCR法检测Apoptin的表达，同时采用激光共聚焦法检测Apoptin在成骨细胞中的亚细胞定位，感染后72小时采用台盼蓝染色法测定细胞生长抑制率。

结果：分别以感染后24小时和48小时的细胞总RNA为模板，经RT-PCR均可扩增出Apoptin cDNA，表明Apoptin已在感染细胞中表达；且感染后细胞出现典型的细胞凋亡所具有的DNA梯状条带，表明有细胞凋亡发生。激光共聚焦检测可见Apoptin定位于细胞核。感染后72小时，几乎所有成骨细胞死亡，表明Osxp-Apoptin重组慢病毒对成骨细胞具有较强的清除作用。

此外，本发明还利用细胞株如小鼠胚胎成骨细胞株MC3T3-E1、颅骨成骨细胞株HCO和人成骨肉瘤细胞株MG-63进行了上述检测，均获得类似结果，证实Osxp-Apoptin重组慢病毒对成骨细胞具有较强的清除作用。

4、对间充质干细胞成骨分化的影响

取原代MSCs进行成骨诱导分化：调整细胞密度为1.0×10⁵个/cm²，接种于6孔板中，加入含有成骨补充成分(浓度为10^-8mol/L的地塞米松、浓度为10^-3mol/L的β-甘油磷酸和浓度为50mg/L的抗坏血酸)的培养基进行诱导培养，分别于诱导后1、3、7和14天按MOI＝40感染Osxp-Apoptin重组慢病毒，并于感染后24小时收集细胞，提取总RNA，采用RT-PCR法检测Osterix和Caspase-3的表达，观察不同成骨分化程度的细胞系对Osterix的反应性。

结果：随着感染后MSCs的成骨分化，Osterix和Caspase-3的表达逐渐增加，表明Osxp-Apoptin重组慢病毒具有良好的针对Osterix的反应性。

5、在体观察对软骨形成的影响

以第三代MSCs作为种子细胞，按MOI＝40感染Osxp-Apoptin重组慢病毒，感染后24小时，胰蛋白酶消化，离心收集细胞，调整细胞密度为2×10⁷个/mL，再与壳聚糖-甘油磷酸钠(C/GP)凝胶混合，充分吹打使混合均匀，用1mL注射器进行裸鼠皮下种植，分别于种植后4、8和12周取出标本，按常规方法进行福尔马林固定、稀硝酸脱钙、石蜡包埋切片，并进行伊红-苏木精(HE)染色、甲苯胺蓝(TB)染色和免疫组化II型胶原染色。

结果：组织学切片上可见类软骨形成并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质和软骨特异性II型胶原，未见明显的骨化灶出现(图8)，表明经Osxp-Apoptin重组慢病毒处理的MSCs在体内成软骨环境下具有良好的成软骨能力，不会产生骨化灶。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒及其制备方法和应用

<160>10

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F1

<400>1

ggggtacccc cacccaggga agcaagatga t                                 31

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R1

<400>2

cggaattccg ggtcccaagg agtcaggcag at                                32

<210>3

<211>2188

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>3

ccacccaggg aagcaagatg atttatgaga ggagctactt attgaagaat ggaaattaaa  60

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<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F2

<400>4

cggatatccg agtaatttca aatgaacgct                                   30

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R2

<400>5

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<210>6

<211>374

<212>DNA

<213>鸡(Gallus gallus)

<400>6

agtaatttca aatgaacgct ctccaagaag atactccacc cggaccatca acggtgttca  60

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tcgctggaat tacaatcact ctatcgctgt gtggctgcgc gaatgctcgc gctcccacgc  180

taagatctgc aactgcggac aattcagaaa gcactggttt caagaatgtg ccggacttga  240

ggaccgatca acccaagcct ccctcgaaga agcgatcctg cgacccctcc gagtacaggg  300

taagcgagct aaaagaaagc ttgattacca ctactcccag ccgaccccga accgcaagaa  360

ggtgtataag actg                                                    374

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F3

<400>7

actccgagtc aagagtagga ttgtagg                                  27

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R 3

<400>8

agaatgggag aatgggagag aag                                      23

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F4

<400>9

atctgcaact gcggacaa             18

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R4

<400>10

gctgggagta gtggtaatca a         21