副溶血弧菌与溶藻弧菌毒力基因分布与抗生素耐药性分析

摘要

两种主要食源性弧菌——副溶血弧菌和溶藻弧菌都是海洋生态环境中广泛分布的正常菌群，同时也是重要的病原弧菌，不仅能使水产养殖动物患病，造成巨大的经济损失，还能导致人类食物中毒和胃肠道感染，危害人体健康。鉴于副溶血弧菌和溶藻弧菌具有高度同源性，而现有研究集中在前者，对于溶藻弧菌的致病机理缺乏了解。本论文在毒力相关基因和抗生素抗性两方面的特性比较副溶血弧菌和溶藻弧菌，通过分析与比较两种弧菌毒力基因分布情况及多药耐受现象之间的异同，为了解这两种弧菌的致病机制、耐药机制、流行病学研究和食品安全风险评估提供指导，主要结果如下：
　　1.针对副溶血弧菌和溶藻弧菌的溶血素基因(trh、tdh、tlh)、毒力调控基因(toxR、toxS)和毒力贡献基因(Collagenase、UreR、FlaA、ompW、AspA、fur)构建了两套多重 PCR体系并运用于从环境和水产品（青口、白贝、和贵妃蚌等）分离的248株副溶血弧菌和128株溶藻弧菌的毒力基因分布调查，发现这11种毒力相关基因在两种弧菌中均有不同程度的分布：tlh、Collagenase、FlaA、ompW和fur基因在两种弧菌中分布较广，toxR和toxS基因次之；而且两种弧菌的毒力基因分布情况都有各自的特点：副溶血弧菌的分离株不携带tdh和trh基因，AspA、toxR和toxS基因的携带率均超过90％；溶藻弧菌则相反，tdh和trh基因的携带率高达38.28%，AspA、toxR和toxS基因的携带率远低于副溶血弧菌。本论文所构建的多重PCR体系以水煮法提取的细菌DNA为模板同时检测两种弧菌的多个毒力相关基因，具有低成本、高灵敏度和高通量的特点，可用于基层大规模大范围的毒力相关基因发布调查。
　　2.结合表型分型技术和分子分型技术，通过PCR反应筛选与致病性高度相关的O3、O4型副溶血弧菌后辅以血清凝集实验加以验证，从收集到的248株副溶血弧菌中筛选出8株O3型副溶血弧菌和9株O4型副溶血弧菌，通过限制性内切酶SfiⅠ酶切后进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型，为环境副溶血弧菌致病株的深入研究提供参考。
　　3.本论文采用 Kirby-Bauer纸片扩散法研究上述副溶血弧菌和溶藻弧菌分离株对水产养殖业中常用的18种抗生素（氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、头孢噻吩、头孢哌酮、头孢呋新钠、头孢唑啉、庆大霉素、链霉素、阿米卡星、万古霉素、多粘菌素B、四环素、复方新诺明、红霉素、环丙沙星、利福平和克林霉素）的耐药状况，发现两种弧菌都对多种抗生素具有不同程度的抗性，多药耐受情况十分严重，以溶藻弧菌为甚。基于环境中溶藻弧菌的存在比副溶血弧菌更为普遍而且对其研究相对不足的现状，本论文的研究结果不仅能用于指导水产养殖行业抗生素的合理规范应用，还能促进对病原弧菌尤其是溶藻弧菌耐药基因定位和耐药机制的研究。

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第一章 前言

1.1 弧菌

1.2 副溶血弧菌和溶藻弧菌

1.3副溶血弧菌和溶藻弧菌的致病因子

1.4 弧菌的耐药性

1.5 弧菌的分型方法

1.6 本论文立题依据及研究内容

第二章 副溶血弧菌与溶藻弧菌毒力基因的分布调查

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 副溶血弧菌O3、O4 型菌株的PFGE分型

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 副溶血弧菌与溶藻弧菌的耐药性研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 主要结论

5.2 创新点

5.3 研究展望

参考文献

附录

在校期间发表的论文及参加的会议

致谢