一种能同时检测副溶血弧菌4个毒力基因的引物以及试剂盒

摘要

本发明涉及一种能同时检测副溶血弧菌4个毒力基因的引物以及试剂盒，该4个毒力基因分别包括不耐热溶血素tlh、耐热性直接溶血素tdh、耐热相关直接溶血素trh和弧菌属异种间的toxR的引物组合，与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明提供了4条不同的特异性引物，故而对副溶血弧菌4个毒力基因的检测结果准确度更高，结合LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，用户只需加入样品，操作简便，仪器配备锂电池，便于现场快检。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种用于同时检测副溶血弧菌4个毒力基因的引物组合及其试剂盒。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)属γ变形菌门，弧菌目，弧菌科，弧菌属，为革兰阴性嗜盐菌。副溶血性弧菌主要分布于富盐的海洋水域和海水鱼、虾、贝等生物。该菌最早于1950年分离自日本大阪，之后相继报道了各种副溶血弧菌引起的食源性疾病病例。目前是我国沿海地区食源性疾病的主要病原弧菌。

副溶血弧菌可产生多种毒力因子，不耐热溶血素(Thermolabile hemolysin，TLH)为副溶血弧菌种特异性基因，可发现于所有的副溶血弧菌分离析中，常用于副溶血弧菌的种特异性基因，作为副溶血弧菌检测的特征性靶基因。对人类致病有关的毒力因子主要有耐热性直接溶血素(Thermostable direct hemolysin，TDH)、耐热相关直接溶血素(Thermostable direct-related hemolysin,TRH)，分别由tdh、trh基因编码，与副溶血弧菌与人类的致病性密切相关。90％的临床分离菌株都具有tdh或trh基因。toxR基因广泛分布于弧菌科细菌，包括副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌等均可检测到。弧菌属异种间的toxR基因序列存在差异，可用作弧菌属内各种的鉴定，或用于种的水平上检测副溶血弧菌。

经典的副溶血弧菌及毒力基因的检测流程为：弧菌的选择性分离培养、生化或分子鉴定、毒力基因检测等，操作过程复杂、耗时长，难以满足对大量水产品或分离菌的快速检测需求。免疫学方法通常针对分离菌株进行，步骤繁琐，易出现交叉反应，未列入副溶血弧菌及毒力基因的检测方法中。目前基于针对毒力基因的聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)是副弧菌溶血的经典方法，但该方法对仪器和操作环境要求高，易出现假阳性。

微流控(Microfluidics)芯片技术可把样品检测过程集成到一个数平方厘米的芯片上，具有集成化、样品消耗少、通量高等优势，而LAMP技术的优点是灵敏度高、反应用时短、基因扩增和产物的检测可一步完成，灵敏度及反应时间均优于PCR反应，将两者结合起来，可实现对核酸的高通量快速检测，对于发展生物分子快速诊断具有重大的意义。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种能同时检测副溶血弧菌4个毒力基因的引物组合。

本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术的现状提供一种应用有上述引物组合的试剂盒。

本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：该4个毒力基因分别包括不耐热溶血素tlh、耐热性直接溶血素tdh、耐热相关直接溶血素trh和弧菌属异种间的toxR的引物组合：

其中，不耐热溶血素tlh的引物为：

上游外引物F3_tlh：GCCTTGTTCGAGACGCTAAC；

下游外引物B3_tlh：GCGGTGAGTTGCTGTTGTT；

上游内引物FIP_tlh：

GACGATGAGCGGTTGATGTCCA-CCCGAAGAGCACGGTTTC；

下游内引物BIP_tlh：

GTACACCCACGCATTGCGCT-GTGCGTGACATCCCAGAAC；

环引物：

LF_tlh：ACAAGGATCACTCGCGTTCAC；

LB_tlh：CGTCTGGTGCTGAGAAGTTTG；

耐热性直接溶血素tdh的引物为：

上游外引物F3_tdh：CGGTCAATGTAAAGGTCTCT；

下游外引物B3_tdh：CGAACACAGCAGAATGAC；

上游内引物FIP_tdh：

GACGTTGTGAATACTGATTGACCAT-GACTTTTGGACAAACCGTAA；

下游内引物BIP tdh：

AATGGTTGACATCCTACATGACTGT-GCTCTTATAGCCAGACACC；

环引物

LF_tdh：CATCTTCGTACGGTTTTCTTTTTAC；

LB_tdh：ATGATAAAGACTATACAATGGCAGC；

耐热相关直接溶血素trh的引物为：

上游外引物F3_trh：TCCCCGGTTAAGGCAATT；

下游外引物B3_trh：GAAGACCGTAGAAATACCATCT；

上游内引物

FIP_trh：CCGATTGACCGTATACATCTTTGTA-GGAGGACTATTGGACAAACC；

下游内引物

BIP_trh：CACAACAGCAGGTTCAAAGTGG-TGCCATCGTATAGTTATGACC；

环引物：

LB_trh：GCGCCTATATGACAGTAAACATCAA；

弧菌属异种间的toxR的引物为：

上游外引物F3_toxR：ATGGATTCCACGCGTTAT；

下游外引物B3_toxR：CGTTCAATGCACTGCTCA；

上游内引物FIP_toxR：

TGAGATTCCGCAGGGTTTGTAA-TTATTTTTGGCACTATTACTACCG；

下游内引物

BIP_toxR：GTTCCGTCAGATTGGTGAGTATC-TAGAAGGCAACCAGTTGTT；

环引物

LB_toxR：GAACGTACCAGTGATGACACC。

为解决第二个技术问题，优选地，所述试剂盒包括反应液、抑制剂，还包括有内参，所述的反应液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH

与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明提供了4条不同的特异性引物，故而对副溶血弧菌4个毒力基因的检测结果准确度更高，结合LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，用户只需加入样品，操作简便，仪器配备锂电池，便于现场快检，特别适合检疫、卫生等部门实施快速检验需要。

附图说明

图1为本发明检测副溶血弧菌毒力基因的工艺流程图；

图2为本发明本实施例3中带有副溶血弧菌基因片段进行检测限实验的质粒10

图3为本发明本实施例3中带有副溶血弧菌基因片段进行检测限实验的质粒10

图4为本发明本实施例3中带有副溶血弧菌基因片段进行检测限实验的质粒10

图5为本发明本实施例3中带有副溶血弧菌基因片段进行检测限实验的质粒10

图6为本发明本实施例3中带有副溶血弧菌基因片段进行检测限实验的质粒10

图7为本发明本实施例3中带有副溶血弧菌基因片段进行检测限实验的质粒10

图8为本发明本实施例3中带有副溶血弧菌基因片段进行检测限实验的质粒100copies/μL的扩增结果图；

图9为本发明本实施例3中阴性对照的扩增结果图。

具体实施方式

以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1)利用引物设计软件设计同时扩增不耐热溶血素tlh、耐热性直接溶血素tdh、耐热相关直接溶血素trh和弧菌属异种间的toxR的多重引物组合；

2)筛选多重引物组合中不耐热溶血素tlh的引物；

3)筛选多重引物组合中耐热性直接溶血素tdh的引物；

4)筛选多重引物组合中耐热相关直接溶血素trh的引物；

5)筛选多重引物组合中弧菌属异种间的toxR的引物；

所述的步骤1)，其中涉及的引物参照实验室海洋分离株相应的GenBan基因序列，其中，不耐热溶血素tlh的基因序列号为GU971653.1，具体见Seq NO.1，耐热性直接溶血素tdh的基因序列号为GU971654.1，具体见Seq NO.2，耐热相关直接溶血素trh的基因序列号为GU971655，具体见Seq NO.3，弧菌属异种间的toxR的基因序列号为AB029910.1，具体见Seq NO.4；

其中将筛选出的4对特异性引物，将其固定在副溶血弧菌检测用微流控芯片中相应位置，对芯片进行封装，所设计引物序列为本发明副溶血弧菌检测用引物。

实施例2

具体步骤为：

1、DNA提取

利用热煮法从标准样品菌株中提取模板DNA，过程如下：

(1)取1ml菌液于Eppendorf管中，离心机12000rpm/min离心2min，弃上清；

(2)用灭菌纯化水后加100ul灭菌水，充分混匀；

(3)99℃金属浴或热水浴10min，后冰浴5min；

(4)离心机12000rpm/min离心2min，收集上清并保存于-20℃备用。

2、模板扩增

2.1将上述提取的DNA与扩增反应液等按2：3比例混合，加入到预先加有副溶血弧菌4个毒力基因检测试剂的微流控检测芯片中，密封后开始恒温扩增，1600r/min离心10s，使样品核酸进入微流控芯片反应孔；再4600r/min高速离心30s，确保样品DNA进入反应检测孔。

反应体系和试剂见表1：

表1.微流控芯片检测体系中50μL反应液的组成

表1中，反应液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH

2.2微流控检测芯片扩增和检测：

采用恒温扩增，不需经PCR扩增过程中变性、退火和延伸等变温过程，整个反应过程在恒温条件下完成，扩增温度设定为63.5℃，反应时间设定为60min。

副溶血弧菌检测用结果判断：

阈值线和内参设定：副溶血弧菌检测时，检测仪阈值线设置为800(一般以非典型S型扩增曲线成Ct值为30时的最高点作为阈值线)，(注：在恒温扩增中，Ct值意义不同于与荧光定量PCR的Ct值不同，与扩增反应时间有关)。

内参可评判试剂有效性，防止实验中假阴性的出现，采用含副溶血弧菌目的基因片段的阳性质粒作为内参。内参应在Ct值<30时，出现扩增曲线，表明实验结果有效。

微流控芯片检测结果判定：实验结果满足以下条件：

1)阳性对照：Ct<30，阳性对照反应孔具明显典型S型扩增曲线；

2)阴性对照：Ct<30，阴性对照反应孔无扩增曲线。

判定标准：

1)阳性反应孔Ct<30，有明显扩增曲线，判定为阳性；

2)阴性：反应孔出现Ct<30，无扩增曲线，判定为阴性。

样品在微流控芯片检测仪进行恒温扩增时，仪器会自动实时检测荧光，形成根据荧光检测的扩增曲线，当某个样品含有副溶血弧菌毒力基因时，相应的检测孔可形成标准S型扩增曲线，该孔即可判断为阳性；没有扩增曲线的孔为判断为阴性，即表明该样本不含有对虾副溶血弧菌核酸。

实施例3

3.检测副溶血弧菌4个毒力基因的引物的敏感性及检测限的验证：

3.1实验材料

3.1.1试剂：反应液；用无菌水分别稀释为1×10

3.1.2仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。

3.1.3检测体系

参照上述的检测体系进行实验操作，然后把上好样的芯片放进恒温扩增仪进行试验检测，扩增结果可如图2、3、4、5、6、7、8、9，从上面图2～9检测限的结果看，图2～图6以及图8的阳性对照的结果都出现了典型的S型扩增曲线，而图7以及图9的结果均在基线位置，说明该检测体系的最低检测限是1×10

实施例4

常规PCR方法比较

4.1、样品采集

对虾养殖场采集待测虾5-10尾，取肝胰腺匀浆；副溶血弧菌标准菌株(tlh/trh/tdh均阳性)、创伤弧菌、霍乱弧菌(非01/非139型)为实验室菌种库。

4.2、样品检测

(1)取5-10尾南美白对虾肝胰腺称重，加5倍体积灭菌生理盐水，充分匀浆，取0.5ml放入灭菌离心管中；

(2)挑取固体培养基培养的副溶血弧菌参考株菌落5-7个，用灭菌生理盐水中制成菌悬液，比浊法测定菌浓度，用灭菌生理盐水将菌稀释至1×10

(3)将菌液按10倍系列稀释至4个梯度，依次获得1×10

(4)取上述组织匀浆液2份，分别加入浓度为1×10

(5)设各个菌悬液对照，采用菌浓度为1×10

(6)阴性对照为虾组织匀浆液中加入灭菌生理盐水，同时设生理盐水空白对照；

(7)取上述样品液，用天根细菌DNA核酸提取盒分析提取DNA，取DNA提取液，按美国食品和药品监督局弧菌BAM进行PCR反应；

(8)取上述DNA提取液，采用微流控检测仪进行核酸测定。

4.3.结果分析

4.3.1检测结果分析

由下表可见，常规PCR对副溶血弧菌4个基因的最低检测检出限为1×10

表2.副溶血弧菌检测试剂盒方法与常规PCR方法效力比较

注：“+”代表检出结果阳性，“-”代表阴性，VP副溶血弧菌，Vv创伤弧菌，Vch霍乱弧菌，混为组织匀浆混合样，生为生理盐水。

反应时间分析

从DNA提取完成计算时间，PCR反应过程2小时，电泳40分种，总耗时2小时40分钟，试剂盒方法总耗时60min；结合检测结果分析，显示本发明的对虾副溶血弧菌检测系统在复杂样品检测中，在保持高灵敏度的同时大幅缩短了整体反应时间。

序列表

<110> 宁波大学、中华人民共和国台州海关、宁波爱基因科技有限公司

<120> 一种能同时检测副溶血弧菌4个毒力基因的引物以及试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 493

<212> DNA

<213> tlh(Artificial Sequence)

<400> 1

catgaactac aaccgtggcg ttccagaagt gaaagcggat tatgcagaag cactgattcg 60

tttgacggac gcaggtgcga agaacttcat gttgatgaca ctgccagacg cgacgaaagc 120

gcctcagttt aagtactcaa cacaagaaga gatcgacaaa attcgtgcga aagtgcttga 180

gatgaacgag ttcatcaagg cacaagcgat gtactacaaa gcgcaaggtt acaacatcac 240

gttgtttgat actcacgcct tgttcgagac gctaacttct gcgcccgaag agcacggttt 300

cgtgaacgcg agtgatcctt gtttggacat caaccgctca tcgtctgtcg attacatgta 360

cacccacgca ttgcgctctg agtgtgcggc gtctggtgct gagaagtttg tgttctggga 420

tgtcacgcac ccaacaacag caactcaccg ctatgttgca gagaaaatgc tagaaagtag 480

caacaactta gcc 493

<210> 2

<211> 570

<212> DNA

<213> tdh(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaacacc aatattttgc aaaaaaatca tttttattta tatccatgtt ggctgcattc 60

aaaacatctg cttttgagct tccatctgtc ccttttcctg cccccggttc tgatgagata 120

ttgtttgttg ttcgagatac aacttttaat acccaagctc cggtcaatgt aaaggtctct 180

gacttttgga caaaccgtaa tgtaaaaaga aaaccgtacg aagatgttta tggtcaatca 240

gtattcacaa cgtcaggtac taaatggttg acatcctaca tgactgtgaa cattaatgat 300

aaagactata caatggcagc ggtgtctggc tataagagcg gtcattctgc tgtgttcgta 360

aaatcagatc aagtacaact tcaacattcc tataattctg tagctaactt tgttggtgaa 420

gatgaaggtt ctattccaag taaaatgtat ttggatgaaa ctccagaata ttttgttaat 480

gtagaagcat atgagagtgg tagtggtaat atattggtaa tgtgtatatc caacaaagaa 540

tcgttttttg aatataaaca tcaacaataa 570

<210> 3

<211> 553

<212> DNA

<213> trh(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaactaa gactctactt tgctttcagt ttgatattgg cttcgatatt ttcagtatct 60

aaatcattcg cgattgatct gccatcaata ccttttcctt ctccagggtc ggctgaactg 120

ttatttgttg ttagaaatac aacaatcaaa actgaatccc cggttaaggc aattgtggag 180

gactattgga caaaccgaaa cataaaaaga aaaccataca aagatgtata cggtcaatcg 240

gttttcacaa cagcaggttc aaagtggtta agcgcctata tgacagtaaa catcaatggt 300

cataactata cgatggcagc tctttctggt tataaagatg gtatttctac ggtcttcaca 360

aaatcagaga aaacaagcct aaagcaagac tattcctcgg taaaatattt tgttgatgac 420

aacgaagaat caataccaag tgtaacttat ttagatgaaa catcagaata ctttgttact 480

gtcgaggcat atgagagcgg aaatgggcat atgtttgtta tgtgcatttc caacaaatta 540

tcatttggtg aat 553

<210> 4

<211> 498

<212> DNA

<213> toxR(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccagctt ctgataacaa tgatgcctct gctaatgagg tagaaacgat cgtagagccg 60

tctttggcga cgtcttctga cgcaatcgtt gaaccagaag cgccagtagt acctgaaaaa 120

gcacctgtgg cttctgctgt gaatccatgg attccacgcg ttattttatt tttggcacta 180

ttactaccga tttgcgtact gctgtttaca aaccctgcgg aatctcagtt ccgtcagatt 240

ggtgagtatc agaacgtacc agtgatgaca cctgtaaatc acccgcaaat caacaactgg 300

ttgccttcta ttgagcagtg cattgaacgc tacgttaagc accatgcaga agactcctta 360

ccagtggaag tgattgccac tggcggacaa aataaccagc tgattttgaa ctacattcat 420

gacagcaacc actcgtatga gaacgtgaca ttgcgtattt tcgcaggtca aaacgatcca 480

acagacatct gcaaataa 498