真眼点藻纲产油微藻的油脂积累及相关基因表达与酶活性特征研究

摘要

以真眼点藻纲3个属的8株微藻:类波氏真眼点藻（Eustigmatos cf.polyphem）、大真眼点藻（Eustigmatos magnus）、波氏真眼点藻（Eustigmatos polyphem）、魏氏真眼点藻（Eustigmatos vischeri）、斧形魏氏藻（Vischeria helvetica）、点状魏氏藻（Vischeria punctata）、星形魏氏藻（Vischeria stellata）和眼点拟微绿球藻（Nannochloropsis oculata）为实验材料，研究了其在改良的BG-11培养基下3种氮源（硝酸钠、碳酸氢铵或尿素）和4种氮浓度（18、9、6和3mmol）的生长及油脂积累状况。通过对这8株微藻在不同培养条件下的藻液pH值、生物量、油脂含量、脂肪酸组成差异的比较分析，筛选出适合该类微藻生长和油脂积累的最适氮源与最佳氮浓度。研究结果如下： （1）真眼点藻纲的这8株微藻都是极具潜力且适合于作为生物燃料的微藻，而真眼点藻属的藻株表现出了比其他两个属更为明显的优势。 （2）随着培养时间延长，以尿素和碳酸氢铵为氮源的藻液pH逐渐降低，培养末期的pH值约在6.0，而以硝酸钠为氮源的藻液pH变化保持在7.0-8.0。 （3）当以尿素为氮源时，微藻能获得较高的生物量。尿素的氮浓度为6mmol时该类微藻能获得较大的油脂产率。 （4）在真眼点藻属中，波氏真眼点藻获得了最高的总脂、中性脂、脂肪酸产率，分别为0.40g/L·d、0.36g/L·d、0.36g/L·d。在魏氏藻属中点状魏氏藻获得了最高的总脂、中性脂、脂肪酸产率，分别为0.31g/L·d、0.31g/L·d、0.31g/L·d。 在以上的研究基础上，选择以波氏真眼点藻和点状魏氏藻为研究材料，进一步研究其油脂的积累机制以尿素为氮源，分别设置两个氮浓度9mmol（高氮组）及3mmol（低氮组）在改良的BG-11培养基中对藻细胞进行培养。对这2株藻从宏观和微观两方面进行研究。宏观方面研究藻细胞的生长情况、生化组分及光合生理状况。微观方面研究藻细胞中心碳代谢过程及油脂合成过程中的关键酶的活性及关键酶编码基因的表达量。研究结果如下： （1）培养过程中藻细胞生物量不断增加，并且低氮组的生物量明显低于高氮组，在高氮组中波氏真眼点藻和点状魏氏藻的最大生物量分别达到10.56g/L和9.45g/L。 （2）随着培养时间的延长，细胞内的油脂含量逐渐升高，碳水化合物含量先升高后降低，可溶性蛋白含量不断降低。在培养末期低氮组的油脂含量明显高于高氮组，低氮组波氏真眼点藻和点状魏氏藻的油脂、碳水化合物、可溶性蛋白含量分别为66.63%、20.11%、9.30%和57.79%、20.71%、9.01%。 （3）氮限制对藻细胞光合生理的影响也非常显著。Fv/Fm、Yield以及ETR在培养过程中均短暂升高后呈下降趋势。光合放氧速率、呼吸速率也是先升高后降低，在第2天达到最大值，其中高氮组的光合放氧速率和呼吸速率都要高于低氮组，在高氮组中波氏真眼点藻和点状魏氏藻的最大呼吸速率分别达到109.09μmol O2?mg-1?min-1和89.51μmol O2?mg-1?min-1。 （4）对藻细胞糖、脂代谢过程中几个关键酶：核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Rubisco）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）、外切1,3-β-葡聚糖酶(β-1,3-Glu)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的活性进行测定，结果显示，Rubisco、UGPase、β-1,3-Glu的活性随着培养时间的延长先升高后降低，且与氮浓度呈正相关，而ACCase的活性与初始氮浓度呈负相关，且随着培养时间延长而不断升高。 （5）对藻细胞中心碳代谢过程中的几个关键酶基因：rbcL、UGPase、β-1,3-glu、accA、pepc（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）、dgat（二酰甘油酰基转移酶）、me（苹果酸酶）、pdat（二酰甘油酰基转移酶）基因转录水平的表达进行测定，结果表明氮对accA、me、dgat、pdat基因有较强的表达诱导作用。

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