同时检测食品中6种ω-6和ω-3多不饱和脂肪酸的高效液相色谱方法研究

摘要

ω-6与ω-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）作为营养强化剂，在食品行业中被广泛应用。研究结果表明，当 PUFAs总摄入量以及ω-6与ω-3 PUFAs比例在适宜范围内有助于预防心血管疾病、肿瘤和提高婴幼儿智力发育等，为了评判富含ω-6与ω-3 PUFAs产品的质量，为消费者合理选择提供基础数据，加强检测ω-6和ω-3 PUFAs的含量和其组成比例成为必要。
　　目前，检测脂肪酸的国标方法和文献方法中，气相色谱法应用较为广泛，但不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acids，UFA）特别是PUFAs存在在高温下分析时其不饱和双键易发生异构化甚至碳链发生断裂的问题，影响测定的准确性，而近年来报道的高效液相色谱法（HPLC）可避免上述问题，但仍存在以下问题：（1）脂肪酸不经过衍生直接被测定的方法，采用200~210 nm的检测波长，测定时抗干扰性差，测定的结果准确性低；（2）大部分脂肪酸柱前衍生测定的方法，前处理方法过程复杂且繁琐，反应条件需严格无水；（3）以2-硝基苯肼盐酸盐（2-NPH·HCl）作衍生剂的柱前衍生化条件温和，前处理简单，可在水相中进行，但因没有脂肪酸衍生产物的标准品，在衍生条件优化研究中，仅通过脂肪酸衍生产物的峰面积或峰高来确定脂肪酸衍生反应的最佳条件，这种方法并不能知道脂肪酸实际的衍生率，影响最终结果的准确性。
　　本文针对上述检测方法存在的缺陷，制备了正十四碳酸苯酰肼（myristic benzh-ydrazide，MBH）对照品；优化了脂肪酸的HPLC柱前衍生条件，建立了测定脂肪酸的HPLC分析方法；优化了样品的皂化条件；对食用油（橄榄油、茶籽油等）、保健食品（鱼油、鱼肝油等）和奶粉（婴幼儿奶粉等）中6种ω-6 PUFAs和ω-3 PUFAs（α-亚麻酸ALA、二十碳五烯酸EPA、二十二碳六烯酸DHA、γ-亚麻酸GLA、花生四烯酸AA、亚油酸LA）进行了检测。实验结果如下：
　　（1）制备了MBH对照品。选取正十四碳酸为代表，合成了MBH化合物，纯化获得的MBH对照品纯度为99.81％。
　　（2）优化了同时检测6种ω-6和ω-3 PUFAs的HPLC柱前衍生条件。通过单因素实验，得到最优的衍生化条件：溶解衍生剂的溶剂为80%乙醇，2-NPH·HCl浓度和添加量分别为0.04 mol/L和200μL，1-EDC·HCl浓度为0.45 mol/L，吡啶浓度为3%，1-EDC·HCl工作液添加量为200μL，60℃水浴加热15 min，最适的pH值范围为4.0~6.0。
　　（3）建立了同时检测6种ω-6和ω-3 PUFAs的HPLC方法，通过筛选流动相组成、流动相pH值和柱温，确定最佳色谱条件为：色谱柱为Sunfire色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为乙腈-水溶液（88:12），采用等度洗脱（88:12），柱温35℃，流速为1.0mL/min，检测波长为400 nm，进样量10μL。
　　（4）优化了样品中脂质的皂化条件。通过单因素实验，得到最优的皂化条件：皂化试剂为KOH乙醇溶液（V（乙醇）:V（水）=4:1），80℃水浴加热40 min；样品经上述条件皂化后，不同加标浓度下目标物的回收率在93.57%~104.99%之间，日内精密度小于1.84%，日间精密度小于2.05%。方法的检出限为0.20~0.25μg/mL，定量限为0.5~0.6μg/mL。
　　（5）本文采用所建立的方法对市售的食用油、保健食品和奶粉中6种ω-6和ω-3 PUFAs进行了检测，发现天然植物油和动物油中，只有深海鱼油含有的6种ω-6和ω-3 PUFAs种类多；测得的目标物的含量与包装上标签标识的含量基本一致，且添加量在国家规定的范围之内；天然植物油中，某品牌芥花油所含的ALA和 LA含量最高，更适于消费者购买；某品牌橄榄油、芥花油、大豆油、鱼肝油中ω-6与ω-3 PUFAs比例在2.27~10.07之间，基本在推荐值范围内；某品牌茶籽油、玉米油、花生油中ω-6与ω-3 PUFAs比例过高，远超出推荐值的最大值；ω-3与ω-6 PUFAs比例为13.06的某品牌深海鱼油适用于我国饮食ω-6 PUFAs过剩的居民，可平衡二者在体内的比例；某品牌婴幼儿1段奶粉中 AA/DHA为2.03:1，基本符合强化奶粉中的添加比例，LA/ALA为11:1，与GB10765-2010婴幼儿配方食品中提供的比例不相符。

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1 前言

1.1应用现状

1.2 本文研究的6种多不饱和脂肪酸的性质及生理功能

1.3食品中6种多不饱和脂肪酸分析检测现状

1.4本论文研究的内容和意义

2 材料与方法

2.1 标准品与试剂

2.2 主要仪器设备

2.3 原料

2.4 溶液配制

2.5 衍生反应的原理

2.6 MBH对照品的制备

2.7 HPLC方法建立研究

2.8脂肪酸皂化条件的优化

2.9方法学评估

2.10实际样品中6种PUFAs的检测

3 结果与分析

3.1 MBH的结构确证

3.2 MBH的纯度检测

3.1 衍生条件优化

3.2验证MA最优衍生化条件的适用性

3.3同时检测6种PUFAs的HPLC分析方法的建立

3.3皂化条件的优化

3.4方法学评估

3. 5实际样品检测

4讨论

4.1衍生前处理方案的确定

4.2 HPLC测定食品中6种多不饱和脂肪酸色谱条件的优化

4.3皂化条件的优化

5 结论

6 创新与展望

6.1本论文的创新之处

6.2存在的问题及展望

致谢

参考文献

附录 作者攻读硕士学位期间获奖和发表论文情况