番茄青枯病拮抗菌的筛选及其生防机制研究

摘要

由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的番茄青枯病化学防治效果差，生物防治具有巨大的潜力。为此，本研究采用室内平板抑菌法，从土壤中筛选得到三株高效拮抗菌JK6、F7和Y-2；采用盆栽试验，研究其对番茄青枯病的防治效果；采用质谱和高效液相色谱方法，鉴定发酵液粗提物中抗菌活性物质；采用荧光定量PCR法，探究拮抗菌施用后土壤中抗菌功能基因数量的变化。主要结果如下：
　　（1）拮抗菌JK6、F7和Y-2对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径分别高达34.7、20.3和21.3 mm，且能高效抑制香蕉枯萎病病原菌等多种植物病原菌，其抑菌圈直径在34.5~45.0 mm之间。通过生理生化试验和16S rRNA基因序列比对，菌株JK6初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株F7和Y-2为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。
　　（2）拮抗菌JK6、F7和Y-2显著降低盆栽番茄青枯病的发病率，其中JK6的生防效率高达58.6％，并能显著促进番茄植株的生长；F7和Y-2的生防效率分别达46.0%和55.5%。
　　（3）采用C18柱过滤和甲醇萃取，结合质谱和高效液相色谱方法分析，菌株JK6、F7和Y-2发酵液中，均检测出表面活性素，其含量分别为：64.42、53.09和31.34 mg.L-1。进一步验证发酵液甲醇萃取物对青枯雷尔氏菌的抑制效果，其抑菌圈直径分别高达23、18和19 mm。由此说明，表面活性素是该菌株具有生防潜能的直接证据。
　　（4）各菌株均检测到合成脂肽类抗菌物质的关键基因srfAB、fenD、ituA、ituC、ituD和yndJ。为此采用荧光定量PCR分析，进一步表征拮抗菌JK6、F7和Y-2施用后，土壤细菌总DNA中功能基因srfAB、fenD、yndJ的拷贝数显著高于对照组。
　　综合以上，芽孢杆菌JK6、F7和Y-2具有多种抑病原菌功能，可有效防治番茄青枯病，其抗菌活性主要成分是表面活性素。各菌株施用后，土壤中表面活性素 srfAB等多种抗病功能基因显著增加，这一研究成果为阐明拮抗菌的活性成分、田间土壤生防分子机制提供了初步的参考和进一步深入研究的方法。同时本文还发现甲基营养型芽孢杆菌这一新型菌剂在植物生物防治的潜力，为拓宽生防菌剂资源提供了较好的思路，可开发为高效微生物菌剂，在农业生产中具有较好的应用潜力。

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1 前言

1.1 番茄青枯病的研究进展

1.2芽孢杆菌的生物防治研究进展

1.3 芽孢杆菌代谢脂肽类抗生素的研究

1.4 目的意义和技术路线

2 材料与方法

2.1 供试材料

2.2 番茄青枯病拮抗菌的分离鉴定

2.3 拮抗菌抑菌广谱性

2.4 相关抑菌物质代谢与生物学性能

2.5 盆栽防效试验

2.6 拮抗菌代谢脂肽类抗生素

2.7 土壤中功能基因RT-PCR检测体系建立

2.8 数据处理

3 结果与分析

3.1拮抗菌的分离鉴定及室内抑菌广谱性

3.2抑菌物质和生物学性能测定

3.3盆栽防效试验

3.4 代谢脂肽类抗生素的分析鉴定

3.5 土壤中功能基因RT-PCR检测结果

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.2 结论与展望

致谢

参考文献

附录一 拮抗菌株JK6、F7和Y-2的16S rRNA序列

附录二 拮抗菌功能基因的序列

附录三 拮抗菌的盆栽防治试验效果图

附录四 攻读硕士学位期间已（待）发表论文和申请专利