食品中沙门氏菌和嗜热链球菌检测方法的建立

摘要

食品中存活的细菌种类繁多，对它们的研究深度也各有不同，建立某种菌的检测方法，可针对其研究程度的差异采取不同的方法。对于研究较为透彻的菌株，其基因结构非常明确，一般采用文献查找及基因分析的方法来确定检测靶标，建立检测方法;但对于那些研究并不深的菌株，在基因序列不明确的情况下，可通过试验法进行靶标筛选，进而建立检测方法。为了对食品中的各类细菌进行更有效的检测，本试验从食品中非常常见的两种菌入手：以引发食物中毒率非常高的食源性致病菌沙门氏菌为研究对象，建立沙门氏菌RPA快速检测方法;以发酵乳制品中常见的发酵菌种嗜热链球菌为研究对象，建立针对sRNA的高灵敏性检测方法。通过对沙门氏菌与嗜热链球菌的研究，将为这两种菌的检测提供新的方法及研究思路，对食品中细菌检测方法的建立具有重要的参考意义。食品中细菌的各类快速检测方法在食品的现场检测中具有很大的应用前景。 主要研究内容及方法如下： 1、建立沙门氏菌重组酶聚合酶等温扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA )快速检测方法。首先是引物及探针的设计，通过相关资料的查阅及基因组序列的比对，选定沙门氏菌基因组中的保守区域KJ883520为检测靶标，设计并合成了8条引物及一条探针。其次是检测方法的建立，对8条正反向引物构成的16对引物组合进行筛选，找到一对扩增效率最高的引物组合，建立检测方法。最后对该检测方法的特异性与敏感性进行评价，结果证明该方法具有很好的特异性，对沙门氏菌的检测限达10个拷贝数。沙门氏菌RPA快速检测方法的建立为食源性病原菌的鉴定提供更加快速简便的方法。 2、以嗜热链球菌K01为研究对象建立针对sRNA的高灵敏性检测方法。首先是预测sRNA的存在，采用Illumina HiSeq2000测序平台对嗜热链球菌K01全基因组进行测序，在数据库中进行比较，对基因组进行基因功能分析。通过对非编码RNA的预测，筛选出15条sRNA。第二步，针对这些sRNA为检测靶标，同时扩增DNA片段与RNA片段，比较检测其DNA和RNA在敏感性上的差异，通过比较筛选出了2条转录本较高的sRNA建立检测方法。以sRNA为靶标检测嗜热链球菌，为食品中细菌检测方法的研究提供新的思路与方向。 综上所述，本试验成功建立针对沙门氏菌的快速检测方法和针对嗜热链球菌的高灵敏性检测方法。

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摘 要

Abstract

缩略语表

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第1章 绪 论

1.1 食品中致病菌

1.1.1 食源性致病菌

1.1.2沙门氏菌

1.2 食品中益生菌

1.2.1 益生菌

1.2.2 嗜热链球菌

1.3 食品中细菌检测方法

1.3.1 食品中细菌常用检测方法概述

1.3.2 RPA检测

1.3.2.1 RPA技术概况

1.3.2.3 RPA技术优势

1.3.2.4 RPA技术发展现状

1.3.3 小RNA检测

1.4 研究内容与目的意义

1.4.1 课题研究内容

1.4.2 课题研究目的与意义

第2章 食品中沙门氏菌快速检测方法的建立

2.1 材料与仪器设备

2.1.1 试验材料

2.1.1.1菌种与培养基

2.1.1.2 主要试剂

2.1.2 仪器设备

2.2 试验方法

2.2.1引物探针的设计与合成

2.2.1.1靶标序列的确定

2.2.1.2引物与探针的设计与合成

2.2.2.1 沙门氏菌的培养

2.2.2.2 沙门氏菌DNA的提取

2.2.3 质粒标准品的构建

2.2.3.1扩增目的片段

2.2.3.2琼脂糖凝胶电泳

2.2.3.3切胶回收

2.2.3.4连接载体

2.2.3.5细菌转化

2.2.3.6转化产物测定

跑胶过程参照2.2.3.2琼脂糖凝胶电泳。

2.2.3.7质粒提取

2.2.3.8 质粒标准品

2.2.4 引物筛选

2.2.5检测方法的特异性

2.2.6 检测方法的敏感性

2.3 结果

2.3.1 质粒构建

2.3.2反应体系的建立

2.3.3 特异性评价

2.3.4 敏感性评价

2.4 讨论

2.5 本章小结

第3章 食品中嗜热链球菌高灵敏性检测方法的建立

3.1 材料与仪器设备

3.1.1试验材料

3.1.1.1菌株与培养基

3.1.1.2主要试剂

3.1.2仪器设备

3.2 试验方法

3.2.1嗜热链球菌K01全基因组测序

3.2.1.1 嗜热链球菌培养及DNA提取

3.2.1.2 测序平台和技术

3.2.1.3 基因组组装

3.2.1.4 基因预测和功能注释

3.2.2 嗜热链球菌K01中sRNA的检测

3.2.2.1小RNA的筛选及引物设计

3.2.2.2 嗜热链球菌DNA的提取

3.2.2.3 嗜热链球菌RNA的提取

3.2.2.4 RNA的逆转录

3.2.2.5 以DNA和cDNA为模板进行PCR扩增

3.3 结果

3.3.1 嗜热链球菌sRNA的预测与分析

3.3.1.1质控统计信息

3.3.1.2基因预测结果

3.3.1.3 GO功能注释

3.3.1.4 KEGG功能注释

3.3.2 sRNA的检测靶标筛选

3.3.3 基因检测与sRNA检测的灵敏度比较

3.4 讨论

3.5 本章小结

结论与展望

参考文献

致谢

个人简历