鲜肉食品中四种食源菌污染的调查及沙门氏菌LAMP检测方法的建立

摘要

沙门氏菌（Salmonella）、大肠杆菌(Escherich iaco li，E.coli) O157:H7、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，Cj）和单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytohenes，Lm）是当前重要的四种食品源性病原菌（简称食源菌）。为了解市售鲜肉食品中四种食源菌的污染状况以及沙门氏菌的流行血清型及耐药现状，本研究对广西4个城市的市售鲜肉食品进行了四种食源菌污染的检测，对Salmonella分离株的进行了血清型和耐药性的分析，同时建立了一种Salmonella的LAMP快速检测方法，为鲜肉食品进行风险性评估及Salmonella快速检测技术提供支撑。
　　2014-2015年采集自南宁、玉林、钦州、百色的超市和自由市场销售的猪肉、鸡肉、牛肉和鸭肉共788份新鲜肉类样品，参考食原菌检测的国家标准方法并结合实验室建立的PCR进行Salmonella、E.coli O157:H7、Cj和Lm四种食源菌的分离培养和鉴定;对分离到的111株沙门氏菌进行血清型鉴定和16种常用抗生素的耐药性试验，同时对氯霉素类、β-内酰胺类、磺胺类、氨基糖苷类和四环素类共5类抗生素中的16种耐药基因设计引物进行耐药基因PCR检测和序列分析，并进一步对耐药表型与耐药基因检测结果进行关联分析;针对沙门菌属保守基因invA设计LAMP引物组，并借助LA-320C实时浊度仪对LAMP反应进行实时监控，
　　借助荧光目视检测试剂钙黄绿素/MnC12指示反应结果，同时对建立的Salmonella-LAMP快速检测方法进行特异性、敏感性的试验以及对100份肉类食品样品的检测试验。
　　结果在788份市售鲜肉样品中，Salmonella的检出率最高(14.1％，111/788)，其后依次为E.coli O157:H7(9.0％，71/788)、Cj(6.2％，49/788)和Lm(1.3％，10/788);111株食源性Salmonella分离株中共检测出了42种血清型另有3株未定型，其中优势血清型为S.derby(25.2％，28/111)、S.agona(18.0％，20/111)和S.enteritidis(7.2％，8/111);分离株对环丙沙星最敏感，对磺胺异恶唑(66.7％)和四环素(63.9％)的耐药率最高。耐受至少三种抗生素的菌株有68株(61.3％)，其中有6个菌株耐受至少10种抗生素。耐药状况呈现地区性差异，以钦州分离株的耐药状况最严重;111株Salmonella分离株中共检测到10种耐药基因，氯霉素类、β-内酰胺类、磺胺类、氨基糖苷类和四环素类5类抗生素中检出率最高的耐药基因分别为flo、blaTEM-I、sulⅡstrB和tetA，5类抗生素耐药基因的检出情况与耐药表型的符合率分别是78.1％、96.2％、81.1％、70.7％和94.4％;建立的LAMP方法特异性强，只扩增Salmonella，对32株不同血清型的Salmonella都可以扩增，对6株非沙门菌属的细菌不扩增，检测灵敏度为8×102copies/μL，比常规PCR的灵敏度高l000倍。建立的LAMP对100份肉类样品的检测结果与Salmonella检测国家标准方法(GB/T4789.4-2010)的符合率为94.4％，检测时间比后者缩短了48小时。
　　本研究的研究结果表明，市售鲜肉食品中4种食源菌均有不同程度的污染而且以Salmonella的最为严重，Salmonella分离株的耐药状况比较严重，建立的Salmonella-LAMP快速检测方法具有快速、准确、灵敏的特点。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

序言

第一章 绪论

1．1 食品安全概述

1．2 食品源性病原菌及其危害

1．3 本研究研究所涉及的四种食源菌

1．3．1 沙门氏菌

1．3．2 大肠杆菌O157:H7

1．3．3 单核细胞增生李斯特氏菌

1．3．4 空肠弯曲菌

1．4 沙门氏菌LAMP检测技术研究进展

1．5 沙门氏菌耐药性及耐药机理

1．5．1 基因突变导致的耐药性

1．5．2 灭活酶或者钝化酶导致的耐药性

1．5．3 外排泵导致的耐药性

1．5．4 可移动基因元件与耐药性

1．5．5 生物被摸与耐药性

1．6 本研究研究的目的及意义

第二章 鲜肉食品中四种食源性病原菌污染状况的调查

2．1 材料

2．1．1 仪器与设备

2．1．2 试剂与培养基

2．2 方法

2．2．1 样品的采集

2．2．2 鲜肉食品中四种食源菌的分离

2．2．3 四种食源菌的PCR鉴定

2．3 结果

2．3．1 四种食源菌的检测结果

2．3．2 Salmonella的检测结果

2．3．3 E．coli O157:H7检测结果

2．3．4 Cj检测结果

2．3．5 Lm检测结果

2．4 小结与讨论

第三章 沙门氏菌血清型、耐药状况及耐药基因的研究

3．1 材料

3．1．1 菌株来源

3．1．2 试剂与培养基

3．2 方法

3．2．1 沙门氏菌血清型鉴定

3．2．2 沙门氏菌耐药表型检测

3．2．3 沙门氏菌耐药基因的检测

3．3 结果

3．3．1 沙门氏菌血清型鉴定结果

3．3．2 沙门氏菌药敏试验结果

3．3．3 沙门氏菌耐药基因检测结果

3．3．4 沙门氏菌耐药基因测序结果

3．3．5 分离株耐药表型与耐药基因的符合情况

3．4 小结与讨论

第四章 沙门氏菌LAMP快速检测技术的建立

4．1 材料

4．1．1 菌种

4．1．2 仪器与设备

4．1．3 试剂

4．2 方法

4．2．1 LAMP引物的设计

4．2．2 DNA的提取

4．2．3 LAMP扩增体系

4．2．4 特异性试验

4．2．5 灵敏度试验

4．2．6 结果的判定方法

4．2．7 田间肉类食品样品试验

4．3 结果

4．3．1 LAMP特异性试验结果

4．3．2 LAMP与PCR灵敏度试验结果

4．3．3 LAMP结果可视化结果

4．3．4 田问肉类食品样品试验结果

4．4 小结与讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

参加的科研项目