南宁市售鲜肉中四种食源菌的监测及沙门氏菌致病性和耐药性的研究

摘要

沙门氏菌(Salmonella spp)、大肠杆菌O157∶H7(Escherichia coli O157∶H7，E.coli O157∶H7)、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni,C.j）以及单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，Lm）是目前世界上重要的四大食源菌，它们能引起人和动物严重的胃肠炎，以及人类的食物中毒，严重者还能导致人和动物的死亡。全球每年因这四大食源菌引起的食物中毒事件屡见不鲜，严重阻碍了经济和社会的可持续发展。本课题研究的目的是为持续了解南宁市市售鲜肉中四大食源菌的污染现状，以及深入研究食源性Salmonella分离株的致病性与耐药性情况。
　　本课题在2015年7月-2016年11月间分别从南宁的5个超市与4个自由市场零售的生鲜鸡肉、鸭肉、牛肉、猪肉中采集了863份样品，参照食品安全国家检验标准并结合本实验室之前建立的PCR检测方法，对鲜肉食品中的四大食源菌进行检测与分离;对分离到的166株Salmonella分离株的血清型进行鉴定，并与本实验室同期分离的159株鸡源Salmonella分离株的血清型进行对比分析;研究了鲜肉源中优势血清型的Salmonella分离株对小鼠的致病力表型，并设计引物对这些菌株的9种毒力基因进行检测;检测了166株Salmonella分离株对16种常见抗生素的耐药表型及其13种耐药基因。
　　863份市售鲜肉中四种食源菌的检测结果显示，Salmonella的检出率最高(19.24％，166/863)，然后依次为E.coli O157∶H7(14.60％，126/863)、C.j(8.92％，77/863)、Lm(0.81％，7/863);对比四种食源菌在超市与自由市场的检出率发现，Sa lm on ella在超市的检出率(22.20％，93/419)高于自由市场的(16.44％，73/444)，而Lm仅在超市样品中检出(1.43％,6/419);不同肉类的检出情况显示，猪肉中Salmonella和E.coli O157∶H7的检出率要高于其他肉类的，禽肉中C.j的检出率要高于其肉类的，而Lm在牛肉中的检出率最高;四种食源菌在不同市场的检出率存在明显的差异，Salmonella在D超市中的检出率最高，E.coli O157∶H7与C.j在I市场中的检出率最高，而Lm仅在E超市中有检出;此外，Salmonella、E.coli O157∶H7在夏秋两季的检出率比冬春两季的相对较高，C.j的检出率在夏季较高，Lm全年各月的检出率均较低，缺乏明显季节性差异。
　　166株鲜肉Salmonella分离株血清型的鉴定结果显示，分离株共涵盖9个血清群的68个血清型，其中优势血清群为B群，优势血清型为S.agona(15.06％)、S.derby(15.06％)、S.enteritidis(5.42％)、S.riggil(4.82％)、S.rissen(3.61％)、S.typhimurium(3.61％)。对比市售鲜鸡肉源与鸡源Salmonella的血清型发现，市售鲜鸡肉中Salmonella血清型共涵盖了8个血清群的30种血清型，其优势血清型为S.agona(15.91％)、S.derby(9.09％)、S.enteritidis(6.82％)、S.menston(6.82％)、S.chartres(4.55％);鸡源Salmonella分离株则涵盖8个血清群的26个血清型，其优势血清群为B群，优势血清型为S.pullorum(75.47％)、S.gallinarum(2.52％);有S.agona、S.typhimurium、S.menston、S.braenderup、S.newlands、S.blegdam共6种血清型在两者中均有检出;肉源的优势血清型S.agona、S.derby、S.enteritidis、S.typhimurium分离株对人工攻毒小鼠均有40％-70％的致死率，而且致死率的高低与菌株毒力岛SPI-2中的sseL基因有关。
　　166株鲜肉Salmonella分离株对八大类共16种常见抗生素的药敏试验结果显示，89.16％(148/166)的分离株对供试的16种抗生素均存在不同程度的耐药性，其中对四环素的耐药率最高(72.29％)，其次为氨苄西林、氯霉素、阿莫西林、复方新诺明;多重耐药检测结果显示，74.10％的分离株对供试抗生素表现出多重耐药性，55.42％的分离株可以耐受2-7种抗生素、10.24％的分离株能耐受10种及以上的抗生素，最多的可耐14种抗生素;对比鸡肉源与鸡源分离株的耐药性的发现，鸡肉源中的多重耐药现象比鸡源的严重，67.44％的鸡肉源分离株表现出多重耐药性，而鸡源的只有28.06％。鸡肉源分离株中10耐及以上的有13.95％，而鸡源的只有2.88％;对β-内酰胺类磺胺类、氨基糖苷类、四环素类四大类抗生素共13种耐药基因的检测结果显示，13种耐药基因均可检出。四大类抗生素的耐药表型与耐药基因的符合率分析显示，符合率都在80.00％以上，其中β-内酰胺类抗生素的符合率最高(96.70％)。
　　本课题研究结果显示，南宁市市售鲜肉食品中均存在四种食源性致病菌的污染，其中Salmonella的污染最为严重，Salmonella分离株的优势血清群为B群，而且优势血清型的分离株对小鼠均有较强的致病性。Salmonella分离株对常见抗生素的耐药性以及多重耐药性严重。

目录

声明

摘要

英语缩略词表

前言

1．1 食品安全的论述

1．2 主要食源性病原菌的概念及其危害

1．2．1 Salmonella spp．

1．2．2 Escherichia coli O157∶H7

1．2．3 Campylobacter jejuni

1．2．4 Listeria monocytohenes

1．3 沙门氏菌耐药性的主要机制

1．3．1 基因突变引起的耐药

1．3．2 酶解作用引起的耐药

1．3．3 外排泵改变引起的耐药

1．3．4 膜通透性降低引起的耐药

1．3．5 生物被膜的形成引起的耐药

1．3．6 可移动遗传元件的转移引起的耐药

1．4 本课题研究的主要目的与意义

第二章 2015-2016年南宁市售鲜肉中四种食源菌的流行调查

2．1 材料

2．1．1 培养基与试剂

2．1．2 样品来源

2．2 方法

2．2．1 样品的采集

2．2．2 四种食源菌的国标分离

2．2．3 四种食源菌的PCR鉴定

2．3 结果

2．3．1 市售鲜肉中食源菌污染情况

2．3．2 市售鲜肉中四种食源菌的检测结果

2．4 小结与讨论

第三章 沙门氏菌分离株的鉴定与致病性试验

3．1 材料

3．1．1 分离菌株的来源

3．1．2 培养基与试剂

3．1．3 实验动物

3．2 方法

3．2．1 分离株血清型的鉴定

3．2．2 部分优势血清型分离株的致病力试验

3．2．3 有关毒力基因PCR扩增引物的设计与合成

3．2．4 样品PCR扩增模板的制备以及毒力基因的PCR扩增

3．3．1 分离株血清型分布情况

3．3．2 市售鲜鸡肉与鸡源分离株血清型比对情况

3．3．3 不同种类鲜肉分离株血清型的比对

3．3．4 市场与超市分离株血清型分布比对情况

3．3．5 优势血清型分离株的致病力试验结果

3．3．6 优势血清型分离株毒力基因的检测结果

3．3．7 优势血清型分离株的致病力与其毒力基因之间的相关性

3．4 小结与讨论

第四章 沙门氏菌分离株对供试抗生素耐药性的研究

4．1 材料

4．1．1 菌株来源

4．1．2 培养基与试剂

4．1．3 药敏纸片

4．2 方法

4．2．1 分离株耐药表型的检测

4．2．2 分离株耐药基因的检测

4．3 结果

4．3．1 分离株耐药表型以及多重耐药状况的检测结果

4．3．2 不同种类鲜肉分离株耐药表型以及多重耐药检测结果对比

4．3．3 市场与超市的鲜肉分离株耐药表型以及多重耐药检测结果对比

4．3．4 鲜鸡肉与鸡源分离株耐药表型以及多重耐药的检测结果对比

4．3．5 鲜肉与鸡源沙门氏菌分离株耐药表型以及多重耐药的检测结果对比

4．3．6 分离株耐药基因的检测结果

4．3．7 分离株耐药表型与耐药基因之间的相关性

4．4 小结与讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

参加的科研项目

发表的论文