植物甾醇-卵磷脂脂质体构建及其在IgY包载的应用

摘要

脂质体由于其具有的生物相容性、靶向性、可控释放性等特点，多用于各种药物的包封。本文以植物甾醇代替一般脂质体中所采用的胆固醇，通过比较研究构建了谷甾醇一卵磷脂脂质体体系，用以考察该体系对于活性蛋白物质的保护作用。所选用的蛋白是从鸡蛋中提取的免疫球蛋白IgY(Immunoglobulin ofYolk)。免疫球蛋白在胃肠道中能发挥其被动免疫功能，增强人体免疫力。但是胃液、肠液，尤其是胃液的酸性环境和蛋白酶水解对于免疫球蛋白的破坏性很大。本实验所构建的谷甾醇一卵磷脂脂质体，有助于在胃肠中保护免疫球蛋白的活性。 论文首先以稳定性和包封率为考察指标，比较了几种常见植物甾醇-谷甾醇、豆甾醇及麦角固醇制备的脂质体，最终确定谷甾醇为其中最优的卵磷脂脂质体配方材料。以谷甾醇-大豆卵磷脂脂质体为模型，考察其对不同分子量大小的蛋白组分(Mr=14000～180000 Da)的包封情况，结果显示：在考察的分子量范围内，不同蛋白质采用相同的制备方法其包封率无显著性差异，说明该体系具有相当的适配性。 选择琼脂糖凝胶CL-2B为分离介质，可以较好地实现IgY脂质体与游离IgY之间的分离，并研究确认Lowry法为脂质体体系中游离IN含量的较理想测定方法。 论文以鸡蛋为原料，采用水稀释和硫酸盐分级沉淀相结合的方法提取实验所需的IgY，经冷冻干燥IgY提取物的蛋白含量达92.53％，IgY占80％以上，其中具有活性的IgY占39.5％。以谷甾醇．脂质体对IgY的包封率最大化为目标，对其工艺制备过程进行了优化。选取甾醇/磷脂质量比、配方蛋白总量、介质pH为考察因素，根据预备实验及参考文献确定三因素的水平范围，以包封率为响应值，利用SAS软件进行实验设计与数据分析，得出的最优化组合为：甾醇/磷脂质量比1:1、介质pH值8.5、配方蛋白总量12 mg，谷甾醇脂质体对IN的包封率预测值为66.045％。按此组合进行验证实验，平均包封率为61.5％，接近预测值，说明该软件的设计模型有效。 模拟胃肠道环境，考察谷甾醇脂质体对所包载IgY的保护作用，结果表明：游离的IgY在人工胃液中1 h内基本失活，而脂质体包载的IgY经人工胃液作用1 h活性残留率为49.8％，2 h后活性残留为44.3％；游离IgY有一定的胰蛋白酶耐受性，作用2 h，活性残留在50％以上，包载在脂质体中的IgY经人工胰液作用2 h，活性保留率在90％以上。说明谷甾醇脂质体有助于提高IgY免受胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶破坏的能力，IgY包载于该脂质体有望成为口服制剂或食品添加剂，用以增强人体的被动免疫能力。论文还比较了胆固醇一卵磷脂脂质体与谷甾醇．卵磷脂脂质体对IgY的保护作用效果，结果表明后者效果更佳。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1免疫球蛋白

1.1.1免疫球蛋白的结构与生理功能

1.1.2 IgY简介

1.1.3异源性免疫球蛋白

1.2脂质体简介

1.2.1脂质体的结构

1.2.2脂质体的实际应用

1.2.3口服脂质体的研究进展

1.2.4植物甾醇作为新型脂质体材料

1.3立题意义与主要研究内容

第二章 蛋黄免疫球蛋白IGY的提取

2.1概述

2.2材料与仪器

2.2.1材料与试剂

2.2.2仪器与设备

2.3实验方法和步骤

2.3.1蛋黄/水体积比的确定

2.3.2介质水pH的确定

2.3.3硫酸盐分级沉淀

2.3.4 IgY提取物的纯度检测

2.4结果与讨论

2.4.1蛋黄最佳稀释比例的确定

2.4.2水介质最佳pH的确定

2.4.3纯化过程中硫酸盐浓度

2.4.4 IgY提取物的纯度检验

2.5本章小结

第三章 植物甾醇脂质体包载IGY的体系构建研究

3.1引言

3.2材料、仪器

3.2.1材料与试剂

3.2.2仪器

3.3实验方法与步骤

3.3.1脂质体制备方法

3.3.2 IgY脂质体包封率的测定

3.3.3植物甾醇的选择

3.3.4植物甾醇脂质体适配性研究

3.4结果与讨论

3.4.1 IgY脂质体与游离IgY的分离

3.4.2 Lowry法测定蛋白含量可行性

3.4.3植物甾醇的选择

3.4.4脂质体对于不同分子量蛋白的包封率

3.5本章小结

第四章 谷甾醇-脂质体包载IGY的工艺优化及质量评价

4.1引言

4.2试剂与仪器

4.2.1材料与试剂

4.2.2实验仪器

4.3实验方法与步骤

4.3.1响应面优化实验

4.3.2脂质体的形态观察

4.3.3脂质体在消化系统中的稳定性研究

4.4结果与讨论

4.4.1响应面优化实验结果及数据分析

4.4.2脂质体包载IgY的形态

4.4.3脂质体在消化系统中的稳定性

4.5本章小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文

致谢

评定意见