滋阴清热方对SLE阴虚内热证患者PBMC基因及蛋白表达谱的影响

摘要

目的：SLE是对人们健康有着严重威胁，中医治疗又很具特色并具有明显疗效的疾病，我们选择临床治疗SLE有效的滋阴清热胶囊，开展滋阴清热胶囊对SLE基因和蛋白组学的研究，探索滋阴清热胶囊作用的基因表达和功能蛋白的微观物质基础，加深对中医药治疗SLE病机病理的理解，寻找有效的治疗SLE中西医结合方法。 方法： 1.制备滋阴清热含药血清和建立外周血单一核细胞孵化实验体系：(1)以滋阴清热胶囊成人剂量换算成按高剂量和等效剂量配制滋阴清热方灌胃液对大白鼠进行灌胃7天，于最后一次灌药后1小时心脏取血，滤膜过滤备用；(2)观察含药血清对SLE患者PBMC的抗ds-DNA抗体影响，确定最佳滋阴清热含药血清作用浓度，并将含药血清对SLE患者PBMC的抗ds-DNA抗体的影响作为滋阴清热含药血清是否有效的参照。 2．观察滋阴清热含药血清对阴虚内热型SLE患者PBMC的基因表达谱影响：抽取阴虚内热型SLE患者静脉血分离PBMC然后(1)提取滋阴清热含药血清孵化后的SLE患者PBMC中的mRNA，(2)将mRNA反转录成cDNA并扩增，将cDNA加入基因芯片中进行检测，得出数据进行分析。 3．观察滋阴清热含药血清对SLE患者PBMC的蛋白表达谱影响：抽取阴虚内热型SLE患者静脉血分离PBMC然后(1)提取滋阴清热含药血清孵化后的SLE患者PBMC中的蛋白，(2)将蛋白加入蛋白芯片中进行SELDI TOF MS检测，得出数据进行分析。 4．设立地塞米松、不含药血清和空白对照组同时进行和滋阴清热含药血清一样的实验步骤。 结果： 1．滋阴清热含药血清和地塞米松能够有效降低SLE患者PBMC的抗ds-DNA抗体浓度； 2．含药血清、地塞米松和不含药血清对PBMC基因表达谱的影响 (1)滋阴清热胶囊含药血清对SLE病人PBMC基因表达谱具有明确调控作用，滋阴清热胶囊含药血清上调了51基因，下调了92个基因，地塞米松对SLE病人PBMC基因表达谱调控中上调85个基因，下调126个基因。不含药血清上调147个基因，下调100个基因。 (2)含药血清、地塞米松和不含药血清对SLE患者PBMC基因表达谱影响的两两比较：含药血清和地塞米松共同上调的基因有2个，共同下调的基因有12个，共同无上调和下调的基因有112个，仅含药血清下调、地塞米松无上调下调12个基因，含药血清上调、地塞米松同时无上调下调9个基因，含药血清同时无上调下调、地塞米松下调12个基因，含药血清同时无上调下调、地塞米松上调14个基因，没有发现含药血清和地塞米松调控方向完全相反的基因。含药血清和不含药血清同时上调8个基因，含药血清和不含药血清同时下调16个基因，含药血清同时无上调下调、不含药血清上调33个基因，含药血清同时无上调下调、不含药血清下调7个基因，含药血清上调、不含药血清同时无上调下调8个基因，含药血清下调、不含药血清同时下调无下调3个基因。 地塞米松和不含药血清同时上调共6个基因，地塞米松和不含药血清同时下调15个基因，地塞米松上调、不含药血清同时无上调下调共27个基因，地塞米松下调、不含药血清同时无上调下调共8个基因，地塞米松同时无上调下调、不含药血清上调3个基因，地塞米松同时无上调下调、不含药血清下调共7个基因。 (3)基因表达谱中筛选出一些基因：含药血清、地塞米松和不含药血清均下调基因有6个，它们是IRF1、FGFR4、POLA2、LOC51042、TGM1 和CEPT1；地塞米松和不含药血清下调，含药血清无上调和下调的基因是PIAGL2：地塞米松和不含药血清上调，含药血清无上调和下调的基因是SMARCA2；含药血清地塞米松上调，不含药血清无上调和下调的基因是SC65和BPNT1；不含药血清上调，含药血清和地塞米松无上调和下调的基因是ZNF75；地塞米松下调，不含药血清和含药血清无上调和下调的基因是LOC51765；地塞米松上调，不含药血清和含药血清无上调和下调的基因是SAS，CD163、NPTXR、HOXB3、RPLPO、IL1R1及没有命名的一个基因；含药血清上调，不含药血清和地塞米松无上调和下调的基因是FGFR1；含药血清下调，不含药血清和地塞米松无上调和下调的基因是DDX6。 3．含药血清、地塞米松和不含药血清PBMC蛋白表达谱的影响中 (1)滋阴清热含药血清对阴虚内热型SLE的蛋白质组学的影响：和空白对照比较共有分子量为7027、4216、4236 Da的蛋白有表达差异，经过软件分析，分子量为7027、8590、7675Da的蛋白可作为模式判别滋阴清热含药血清和空白对照的差别。 (2)地塞米松对阴虚内热型SLE的蛋白质组学的影响：和空白对照比较共有分子量为312Da的蛋白有表达差异，经过专业软件分析，分子量为3864、2929、3651、3676Da的蛋白可作为模式判别地塞米松和空白对照作用的差别。 (3)不含药血清对阴虚内热型SLE的蛋白质组学的影响：和空白对照比较共有分子量为7027、2798、4236、5270、4469、2908、4436、3104、1280、2311、4085Da的蛋白有表达差异，经过专业软件分析，分子量为7027和5270Da的蛋白可作为模式判别不含药血清和空白对照作用的差别。 (4)滋阴清热含药血清和不含药血清对阴虚内热型SLE的蛋白质组学比较：滋阴清热含药血清和不含药血清比较分子量为2800Da的蛋白有表达差异，经过专业软件分析，分子量为2800，3551和5877Da的蛋白可作为模式判别滋阴清热含药血清和不含药血清作用的差别。 结论： 1．滋阴清热胶囊具有独自的对阴虚内热型SLE药理作用，基因表达谱结果更是说明这种作用和地塞米松作用有很多相似之处。 2．滋阴清热胶囊以能调控多个基因、多种功能蛋白为特色的发挥作用，作用形式符合中医整体观哲学思想，同时这种作用对SLE的影响又是复杂的。 3．通过对含药血清、地塞米松和不含药血清阴虚内热型SLE的一些基因和蛋白影响的研究，可能为我们提供研究SLE发病和防治新的途径。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

技术路线图

第一部分 研究背景

一、系统性红斑狼疮概况

（一）系统性红斑狼疮病名由来和诊断标准

（二）中医病名和病因病机

二、SLE中西医研究近况

（一）SLE中医研究近况

（二）SLE发病和治疗西医概况

三、基因和蛋白质组学的发展和在SLE中的应用

（一）基因和蛋白质组学的发展

（二）生物信息学技术

（三）基因和蛋白组学在SLE的应用

小结

第二部分 前期系列实验

实验一：含药血清制备

一、实验目的

二、实验步骤

实验二：SLE外周血单一核细胞（PBMC）分离与孵化

一、实验目的

二、实验步骤

实验三：SLE患者PBMC抗ds-DNA抗体检测

一、实验目的

二、实验步骤

实验四：含药血清对SLE患者PBMC的抗ds-DNA抗体影响的实验

一、实验目的

二、实验步骤

三、实验结果

实验五：总RNA提取

一、实验目的

二、实验步骤

实验六 ：总蛋白提取

一、实验目的

二、实验步骤

第三部分 含药血清对SLE患者PBMC的基因表达谱影响

一、材料仪器

（一）试剂

（二）仪器

（三）应用软件

二、基因表达谱研究的具体实验方法

（一）、RNA微量扩增

（二）、探针标记

（三）、人类基因表达谱芯片的设计和生产

（四）、芯片杂交

（五）、扫描和数据处理

三、基因表达谱研究具体实验步骤

（一）样品质检及总RNA提取

（二）探针标记和芯片杂交结果

（三）芯片表达谱结果及生物信息学分析

四、结合专业的数据分析和结果

（一）不含药血清、地塞米松和含药血清对PBMC基因表达的影响

（二）含药血清、地塞米松和不含药血清对PBMC基因组学影响的两两比较

（三）含药血清、地塞米松和不含药血清三者比较中一些有意义的基因

五、讨论

（一）含药血清、地塞米松和不含药血清对对SLE病人PBMC基因表达谱的影响

（二）含药血清、地塞米松和不含药血清对SLE患者PBMC基因表达谱影响的两两比较

（三）基因表达谱中筛选出一些基因的功能和意义分析

小结

第四部分 含药血清对SLE患者PBMC的蛋白表达谱影响

一、材料仪器

（一）主要仪器设备

（二）主要试剂和耗材

（三）实验常用试剂的配制

二、实验方法

（一）淋巴细胞总蛋白质提取

（二）淋巴细胞蛋白质表达谱的获得

（三）数据处理与统计分析

三、结果

（一）不含药血清组和空白对照组SELDI-TOF-MS蛋白表达的比较

（二）地塞米松组和空白对照组SELDI-TOF-MS蛋白表达的比较

（三）含药血清组和空白对照组SELDI-TOF-MS蛋白表达的比较

（四）含药血清组和不含药血清组SELDI-TOF-MS蛋白表达的比较

四、讨论

（一）SELDI-TOF-MS技术背景

（二）结果分析

结语

一、本研究的特色与创新

二、存在的问题和研究展望

三、结论

参考文献

攻读博士学位期间发表论文和参与的科研

附录

致谢