β-细辛醚对转基因小鼠学习记忆及PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的影响

摘要

背景：
　　随着经济的迅速发展，老龄化进程加快，老年人群中痴呆的患病率急剧上升。到2040年我国的痴呆患者数将相当于世界发达国家痴呆人数的总和。我国目前有1.3亿老年人，其中，痴呆病患者达500万～600万。估计到21世纪中叶，我国老年人口将增加到4亿，而痴呆病患者可能达到1600万～2000万。到那时，痴呆将成为我国一个重要的公共健康问题。
　　中药在防治老年性痴呆疾病方面拥有丰富的理论、实践经验以及潜在的优势。阐明中药防治痴呆多靶点作用的药理机制，研制能延缓痴呆进程、提高患者生活质量的中药新药将具有重要的现实意义和广阔的应用前景。
　　研究表明，石菖蒲的有效成分β-细辛醚可以改善AD动物模型的学习记忆能力并且对AD细胞模型具有一定的保护作用。其作用机制可能与其抑制细胞凋亡的作用有关。为了进一步明确β-细辛醚对AD动物模型的治疗效果及其抑制神经细胞凋亡的具体途径，本试验拟分别借助APPswe/PS1dE9双转基因小鼠模型和谷氨酸损伤的PC12细胞模型，研究β-细辛醚改善AD动物模型学习记忆能力的治疗效果以及对神经细胞保护作用和PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的影响。
　　目的：
　　研究石菖蒲活性成分β-细辛醚对 APPswe/PS1dE9双转基因小鼠学习记忆的影响以及对PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的影响。证实β-细辛醚治疗AD的疗效并深入探讨其对抗神经元凋亡作用及机制。
　　方法：
　　体内实验中，4.5月龄SPF级雄性APPswe/PS1dE9双转基因小鼠55只，随机分为模型组、β-细辛醚低剂量组、β-细辛醚中剂量组、β-细辛醚高剂量组、安理申阳性药物对照组。使用同龄同背景B6鼠12只作为正常对照。β-细辛醚低、中、高剂量组给药剂量分别为21.2mg/kg/d，42.4mg/kg/d，84.8mg/kg/d，安理申给药剂量为2mg/kg/d，模型组和正常对照组以蒸馏水灌胃，每日1次，给药共2.5个月。给药结束后，采用Morris水迷宫和避暗实验两种方法检测空间学习记忆能力；采用Western Blot和PCR法检测小鼠脑皮之内APP和PS1的表达情况；采用Western Blot法检测小鼠脑组织p-PI3K、p-Akt、t-Akt、Bcl-2、Bax的表达。
　　体外实验中，不同剂量的β-细辛醚预保护PC12细胞1h，用25mmol/l谷氨酸诱导细胞凋亡，在不同时点采用MTT法检测细胞活力；采用镜下观察进行细胞突触计数；采用Western Blot法检测细胞内 p-PI3K、p-Akt、t-Akt、Bcl-2、Bax的表达。
　　结果：
　　1.体内实验：
　　（1）与正常组相比较，双转基因小鼠水迷宫实验逃避潜伏期明显延长（P<0.05），避暗实验中的错误次数显著增多（P<0.05）。与模型组比较，中剂量β-细辛醚组可明显减少避暗实验中的进入暗箱次数（P<0.05）。而安理申组和β-细辛醚高剂量组仅在水迷宫避暗实验中表现出改善同月龄双转基因小鼠学习记忆的作用趋势（P>0.05）。
　　（2）7月龄 APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑皮质与同型野生型小鼠相比较，脑皮质APP表达量明显增多（ P<0.01）。安理申组和β-细辛醚各剂量组均未能减少APPswe/PS1dE9双转基因小鼠大脑皮质APP的表达量（P>0.05）。
　　（3）7月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑皮质内p-Akt/Akt的相对表达量较正常组增多（P<0.05），安理申组、β-细辛醚低、中剂量组均能明显下调p-Akt/Akt的相对表达量（P<0.05）。
　　（4）与正常组相比，APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑皮质中Bcl-2/Bax的相对表达量减少（P<0.01）。中剂量β-细辛醚可明显增加小鼠脑皮质内 Bcl-2/Bax相对表达量（P<0.05），安理申组和β-细辛醚高剂量组仅表现出上调转基因小鼠脑皮质神经元Bcl-2/Bax相对表达量、改善转基因小鼠脑皮质凋亡的作用倾向（P>0.05）。
　　2.体外实验
　　（1）25mmol/L的谷氨酸作用于PC12细胞3h、6h、12h、24h均可明显降低细胞存活率（P<0.05）。3.125-100umol/L浓度的β-细辛醚作用于谷氨酸损伤的PC12细胞3h，6h，12h，24h，均未能见其增加细胞的存活率（P>0.05），但在6h和12h，6.25umol/L、12.5umol/L、25umol/L的β-细辛醚具有增加细胞存活率的作用趋势（P>0.05）。
　　（2）25mmol/L谷氨酸作用于PC12细胞3h即可对其贴壁构成影响，抑制细胞突触生长，且6h以后其损伤作用呈更加明显的趋势（P>0.05）。β-细辛醚具有促进细胞突触生长的作用趋势，并且发挥作用在3h内即可起效，但3h后β-细辛醚对细胞损伤作用趋势逐渐显现，使细胞突触数量减少（P>0.05），但对细胞折光度等短时影响不明显。
　　（3）25mmol/L谷氨酸作用于 PC12细胞6h，可下调细胞 p-Akt/Akt的相对表达量（P<0.01），下调Bcl-2/Bax的相对表达量（P<0.01）。6.25umol/L的β-细辛醚组细胞p-Akt/Akt的相对表达量较模型组显著增加（P<0.01），6.25umol/L、25umol/L的β-细辛醚组细胞Bcl-2/Bax的相对表达量较模型组显著增加（P<0.01）。
　　结论：
　　1．APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的空间记忆和学习认知的能力障碍，以42.4mg/kg/d剂量的β-细辛醚给予4.5月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠连续灌胃2.5个月，可有效改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠空间记忆以及学习认知的能力。
　　2．β-细辛醚改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠学习记忆能力的作用可能并非通过减少APP表达而实现，而是通过抑制神经细胞凋亡从而发挥神经保护作用来实现的。3．β-细辛醚可以通过激活细胞PI3K/Akt/Bcl-2信号通路从而抑制神经细胞的凋亡，但这并非其对抗神经细胞凋亡唯一的作用机制，其它机制有待于进一步探讨。4．β-细辛醚可能由于其抗凋亡作用成为治疗AD的潜在药物。

目录

声明

引言

第一章 文献综述

第一节 阿尔茨海默病的发病机制

一、遗传相关因素

二、非遗传因素

第二节 阿尔茨海默病与神经元凋亡

一、细胞周期异常与神经元的凋亡

二、谷氨酸受体、Ca2+ 平衡的失调与神经细胞凋亡

三、内质网应激与AD

四、线粒体损伤与线粒体自噬

五、PI3K/Akt信号通路与AD的发生

第三节 中医对痴呆的认识以及中医药对痴呆治疗概况

一、古代文献对老年性痴呆病名及症状的描述

二、中医学对痴呆病机的认识

三、石菖蒲及其活性成分治疗老年性痴呆的实验研究概况

第二章 体内实验

第一节 不同剂量β-细辛醚对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠学习记忆的影响

一、材料与方法

二、学习记忆能力测试

三、实验结果

四、讨论

五.结论

第二节 不同剂量细辛醚对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑皮质PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的影响

一、关于APPswe/PS1dE9双转基因小鼠模型相关指标的检测

二、不同剂量β-细辛醚对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠大脑皮质PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的影响

三、讨论

四、结论

第三章 β-细辛醚对谷氨酸损伤的PC12细胞保护作用的研究

第一节 β-细辛醚对谷氨酸损伤的PC12细胞保护的有效剂量的筛选

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

一、材料与方法

二．结果

三、讨论

四、结论

第三节β-细辛醚对谷氨酸诱导的PC12细胞PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的影响

一、材料与方法

二、结果

三．讨论

四．结论

结语

一、研究结论

二、创新点

三、问题与展望

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢