PI3K特异性抑制剂对小鼠合子基因组激活的影响及体外发育小鼠2-细胞胚内ERα与PI3K/Akt的关联性

摘要

目的：
　　1、观察PI3K特异性抑制剂LY294002对昆明（KM）小鼠1-细胞胚（hCG后27h）体外发育，以及2-细胞胚（hCG后42h）内合子基因组激活（zygotic gene activation，ZGA）相关基因（如：eiF-1A和MuERV-L）表达水平的影响。
　　2、观察ERα特异性抑制剂MPP对体外发育KM小鼠2-细胞胚内PI3K/Akt信号通路的影响，以及抑制PI3K/Ak t信号通路对2-细胞胚内ERα表达的影响，探讨体外发育小鼠2-细胞胚内ERα与PI3K/Akt的关联性。
　　方法：
　　1、收集KM小鼠1-细胞胚，观察其在添加PI3K抑制剂LY294002的M16培养液中的发育情况。
　　2、收集M16对照组和LY294002（50μM）实验组中体外发育KM小鼠2-细胞胚，用Real-time PCR分析合子基因组激活相关基因的表达水平。
　　3、分别收集M16对照组和LY294002（50μM）实验组中体外发育KM小鼠2-细胞胚。
　　（1）激光共聚焦扫描显微镜分别观察ERα和p-ERα蛋白的定位。
　　（2）Western blot方法检测ERα和p-ERα蛋白水平。
　　（3）Real-timePCR分析ERα基因表达的变化。
　　4、分别收集M16对照组和MPP（25μM）实验组中体外发育KM小鼠2-细胞胚。
　　（1）激光共聚焦扫描显微镜分别观察Akt和p-Akt蛋白的定位。
　　（2）Western blot方法检测Akt和p-Akt蛋白水平。
　　结果：
　　1、小鼠1-细胞胚在添加LY294002的M16培养液中，4-细胞胚和囊胚的发育率均明显低于M16培养液对照组，对4-细胞胚的抑制作用呈剂量依赖性，其差异有统计学意义（P<0.05），Real-timePCR结果显示：LY294002实验组中，2-细胞胚内合子基因组激活相关基因eiF-1A表达水平明显低于对照组，其差异有统计学意义（P<0.05）；MuERV-L表达水平略高于对照组，其差异无统计学意义（P>0.05）。
　　2、M16对照组和添加LY294002（50μM）实验组：
　　（1）激光共聚焦扫描显微镜检测结果显示：对照组中ERα在细胞质和细胞核中均呈均匀分布，而以细胞核内分布为主，p-ERα在细胞质和细胞核中均有分布；LY294002（50μM）实验组 ERα定位与对照组类似，但细胞质和细胞核内出现少量不均匀分布的粗颗粒，p-ERα除了具有对照组分布特征外，细胞核p-ERα荧光相对强度明显减弱，且细胞质内出现较多不均匀分布的粗颗粒；
　　（2）Westernblot结果显示，实验组2-细胞胚内p-Akt几乎检测不到，ERα蛋白水平略有升高，但无统计学意义（P>0.05）；但p-ERα蛋白水平明显降低（P<0.05）；
　　（3）Real-time PCR结果显示，实验组2-细胞胚中ERα mRNA表达水平较对照组升高，但无统计学意义（P>0.05）。
　　3、M16对照组和添加MPP（25μM）实验组：
　　（1）激光共聚焦扫描显微镜检测结果显示：Akt定位于细胞膜上，p-Akt分布在细胞膜、细胞质和细胞核中，对照组和实验组2-细胞胚内Akt和p-Akt的定位和荧光相对强度没有明显区别；
　　（2）Western blot结果显示，与对照组相比，实验组Akt蛋白表达量略有降低，但无统计学意义（P>0.05）；而p-Akt蛋白表达量略为升高，其差异亦无统计学意义（P>0.05）。
　　结论：
　　PI3K特异性抑制剂LY294002明显抑制小鼠1-细胞胚的体外发育率，且呈剂量依赖性。eIF-1A基因作为ZGA发生的时标，在小鼠2-细胞胚中期出现明显的高表达，而LY294002能明显下调eIF-1A基因在2-细胞胚（hCG后42h）内的表达，从而证实PI3K对ZGA可能起着重要调节作用；其次，在LY294002的作用下小鼠2-细胞胚内p-ERα蛋白水平明显降低，而在MPP的作用下，Akt、p-Akt蛋白水平没有显著变化，结果提示，在小鼠2-细胞胚内，抑制PI3K/Akt信号通路可下调ERα活性。

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英文缩略语表

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第一部分PI3K特异性抑制剂对小鼠合子基因组激活的影响

材料和方法

一 材料

二 方法

三 统计学处理

四 结果

讨论

第二部分 体外发育小鼠2-细胞胚中ERα与PI3K/Akt的关联性

材料和方法

一 材料

二 方法

三 统计学处理

四 结果

讨论

总结

参考文献

致谢

雌激素受体ERα与PI3K/Akt细胞信号通路

参考文献