母亲MTHFR、eNOS基因多态性及环境因素与NTDs关系的研究

摘要

目的:探讨影响贵州省神经管畸形(neural tube defects, NTDs)高发的可疑危险因素,研究母亲5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene-tetrahydrofolate reductase, MTHFR)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric synthase, eNOS)基因多态性及环境因素与子代发生NTDs之间的关系,并研究危险因素之间是否存在交互作用,为预防NTDs的发生提供理论依据。
　　方法:监测2010年10月至2013年11月间贵州省9个地、州、市所属的63所医院生育NTDs患儿或被B超诊断为NTDs患儿而引产的母亲155例组成病例组,选取155例同期与病例组孕周相近的孕妇或生育正常儿的母亲组成对照组,采用1:1匹配的病例对照研究的流行病学方法。对两组研究对象进行问卷调查,并采集其肘静脉血各5ml,提取DNA。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)的方法对研究对象的MTHFR基因677位点及eNOS基因894位点和4a/b位点多态性进行检测;应用高效液相色谱法检测病例组和对照组的糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin Alc, HbAlc)值,组间比较用配对t检验;采用SPSS13.0软件对数据进行单因素和多因素条件logistic回归分析,并应用GMDR vo.7软件对基因-基因、基因-环境之间的交互作用进行分析。
　　结果:MTHFR基因677位点突变存在三种类型:野生型CC、纯合突变型TT和杂合突变型CT,PCR产物测序的结果与限制性酶切结果相吻合。其基因型频率(CC、TT、CT)在病例组的分布为47.7％、21.3%、31.0%,对照组为63.9%、7.1%、29.0%,经卡方检验两种基因型频率的差异具有统计学意义(χ2=14.69, P=0.001);等位基因频率(C、T)在病例组的分布为64.8%和35.2%,对照组为78.4%和21.6%,经卡方检验两种等位基因频率的差异具有统计学意义(χ2=13.99, P=0.000)。
　　eNOS基因894位点突变存在三种类型:野生型GG、杂合突变型GT和纯合突变型TT, PCR产物测序的结果与限制性酶切结果相吻合。其基因型频率(GG、GT、TT)在病例组的分布为61.3%、29.7%、9.0%,对照组为76.1%、20.7%、3.2%,两种基因型频率的差异经卡方检验具有统计学意义(χ2=9.26, P=0.010);等位基因频率(G、T)在病例组的分布为76.1%和23.9%,对照组为86.5%和13.5%,病例组与对照组采用卡方检验,两组等位基因频率的差异具有统计学意义(χ2=10.86, P=0.001)。
　　eNOS基因4a/bVNTR由a等位基因和b等位基因构成,分为a/a、a/b和b/b三种基因型。在本次实验中对照组无a/a基因型、病例组也仅发现一例。其基因型频率(a/a、a/b、b/b)在病例组的分布为0.6%、12.3%、87.1%,对照组为0.0%、10.3%、89.7%,经卡方检验两种基因型频率的差异无统计学意义(χ2=0.14, P=0.704);等位基因频率(a、b)在病例组的分布为93.2%和6.8%,对照组为94.8%和5.2%,经卡方检验两种等位基因频率的差异无统计学意义(χ2=0.72, P=0.397)。
　　应用高效液相色谱仪检测HbAlc,分析HbAlc水平与NTDs的相关性。结果显示病例组HbAlc水平(5.14±1.36)明显高于对照组HbAlc水平(4.83±0.38),两组间的差异具有统计学意义(t=2.09, P=0.040)。
　　将单因素条件logistic回归分析中具有统计学意义的11项变量分别引入到多因素条件logistic回归分析,最终进入模型的变量有6项:被动吸烟、文化程度、食用发芽马铃薯、妊娠剧吐、MTHFR基因677位点突变、eNOS基因894位点突变,其OR值及95%CI分别为3.430(1.608~7.317)、0.488(0.320~0.744)、2.017(1.155~3.523)、2.868(1.407~5.849)、2.051(1.258~3.344)、3.650(1.902~7.003)。
　　交互作用分析结果显示如下:将多因素分析有意义的可疑危险因素录入至GMDR v0.7软件,对基因与基因、基因与环境之间的交互作用进行分析。结果显示,有一个模型的交叉检验一致性均为10/10,平衡准确度为0.6439,说明MTHFR基因677位点突变、eNOS基因894位点突变、妊娠剧吐、文化程度、被动吸烟和食用发芽马铃薯之间存在交互作用。
　　结论:MTHFR基因677位点突变、eNOS基因894位点突变可能与贵州省NTDs的发生有关。HbAlc水平与NTDs的发生具有相关性。母亲高文化程度是NTDs发生的独立保护因素。MTHFR基因677T位点突变、eNOS基因894位点突变、妊娠剧吐、文化程度、被动吸烟和食用发芽马铃薯间存在交互作用。

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前言

1 研究对象与方法

1.1 确定研究对象

1.2 采集样本

1.3 调查表的设计

1.4 研究资料的收集

1.5 实验仪器和试剂选择

1.6 实验方法

1.7 相关基因片段序列的测定

1.8 统计学分析方法

2 结果

2.1 研究的一般情况

2.2 MTHFR和eNOS基因多态性的实验结果

2.3 糖化血红蛋白检测结果

2.4 将NTDs可疑影响因素进行单因素条件Logistic回归分析

2.5 NTDs可疑影响因素的条件多因素Logistic回归分析

2.6 可疑因素引发NTDs的基因与基因、基因与环境交互作用分析

3 讨论

3.1 相关环境因素与NTDs发生的关系

3.2 糖化血红蛋白与NTDs的关系

3.3 MTHFR基因多态性与NTDs的关系

3.4 eNOS基因多态性与NTDs的关系

3.5 基因与基因的交互作用

3.6 基因与环境之间的交互作用

4 结论

参考文献

综述

致谢

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