脊髓背角HCN通道在神经病理性疼痛中的作用及机制研究

摘要

外周神经损伤后造成的神经病理性疼痛是临床上多见而难以治疗的慢性疾痛，对人们的身体健康造成严重影响。因此，揭示其发生机制、进一步研发效果良好而副作用小的镇痛药物是疼痛研究领域的热点。以往研究表明，外周神经损伤引起的背根神经节和脊髓背角神经元兴奋性增高是产生神经病理性疼痛的关键。脊髓背角是痛觉传导过程中重要的整合中枢，新近研究发现，分布于脊髓背角的超极化激活环核苷酸门控( hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated, HCN)通道在病理性疼痛的调节起重要作用，但其机制不清楚。此外，嘌呤能 P2X受体与疼痛密切相关，研究表明表达于脊髓背角神经元的P2X受体的激活促进了病理性疼痛的发生、发展。HCN通道与P2X受体均表达于脊髓背角神经元，那么，HCN通道是否通过影响背角神经元P2X受体的功能，进一步调节神经元的兴奋性及伤害性信息的传递，目前尚不清楚。本课题通过制作大鼠坐骨神经痛模型，结合在体和离体研究，综合应用行为学、分子生物学等方法，从以下几个方面进行观察：1） HCN通道在坐骨神经缩窄性损伤（chronic constriction injury，CCI）所引起的神经痛中的作用；2）HCN通道是否调节CCI大鼠脊髓背角神经元P2X受体的表达；3）HCN通道对培养的脊髓背角神经元P2X受体功能的影响。本课题从不同角度探讨HCN通道在神经病理性疼痛中的作用及相关机制，为开发以HCN通道为靶点的新型镇痛药提供理论基础。
　　目的：
　　1.观察脊髓背角神经元HCN通道在神经病理性疼痛中的作用；
　　2.观察HCN通道对培养的脊髓背角神经元P2X受体功能的调节作用及机制。
　　方法：
　　1.在体实验：7～8周龄成年SD大鼠（雄性）48只随机分为6组：(1)sham组(假手术组)、(2)CCI组(鞘内注射生理盐水)、(3)~(6) CCI+ZD7288(鞘内分别注射1,10,30,50μg ZD7288)，每组8只。CCI及CCI+ZD7288组大鼠在鞘内置管恢复5d后给予CCI术，术后鞘内给药（2次/日，持续14d）；sham组大鼠不进行鞘内置管，仅游离坐骨神经，不结扎。行为学检测：热痛阈测定；免疫印迹技术检测：脊髓背角HCN1,3,4通道、P2X2,6受体、P-PKA蛋白表达水平；
　　2.离体实验：培养出生三天以内的SD乳鼠脊髓背角神经元，分为7组：①对照组；②ATP组（100μmol/L）；③无钙液+ATP组，无钙液预先孵育20min，再加入ATP；④TNP-ATP（10μmol/L）+ATP组， TNP-ATP预先孵育10min，再加入ATP；⑤ZD7288（1,10,100,1000umol/L）+ATP组，不同浓度ZD7288先孵育10min，再加ATP；⑥8-Br-cAMP（100μmol/L）+ATP组；⑦ZD7288（100μmol/L）+8-Br-cAMP（100μmol/L）+ATP组，先加ZD7288孵育10min，再加cAMP孵育10min，最后加ATP。运用激光共聚焦显微镜技术观察神经元[Ca2+]i的动态变化。
　　结果：
　　1.大鼠CCI术后即第1d即形成稳定的热痛敏，至第14d热痛敏仍持续存在，TWL明显缩短（P＜0.05）；鞘内给予30μg HCN通道阻滞剂ZD7288可明显延长CCI大鼠的TWL（P＜0.05）。Western Blot结果显示，CCI组大鼠在术后7、14 d术侧脊髓背角HCN1,3,4、P2X2,6及P-PKA表达显著增加（P＜0.05）；鞘内给予ZD7288可显著降低CCI大鼠HCN1,3,4,P2X2,6及P-PKA的表达（P＜0.05）。
　　2.ATP（100μmol/L）可导致脊髓背角神经元[Ca2+]i升高，是由 P2X受体介导的细胞外Ca2+内流所致（P＜0.05）；HCN通道拮抗剂ZD7288（10-1000μmol/L，预孵育10min）可抑制ATP（100μmol/L）引起的脊髓背角神经元[Ca2+]i增高，且呈现剂量依赖性；8-Br-cAMP（cAMP类似物,100μmol/L）可增强ATP引起的脊髓背角神经元[Ca2+]i升高，ZD7288（预孵育10min）可显著抑制8-Br-cAMP的效应（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.脊髓背角HCN通道的激活可促进CCI所致的神经病理性疼痛的发生与维持；同时，神经痛时脊髓背角HCN通道的激活可促进嘌呤能P2X受体的表达。
　　2.HCN通道拮抗剂ZD7288显著抑制脊髓背角神经元P2X受体诱发的[Ca2+]i升高，说明脊髓背角神经元HCN通道可促进嘌呤能P2X受体的功能。

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前言

一 、HCN通道参与病理性疼痛的调节

二、P2X受体参与病理性疼痛的调节

三、脊髓背角神经元HCN通道对P2X受体的调节作用

技术路线

第一部分脊髓背角HCN通道在神经病理性疼痛中的作用

中文摘要

Abstract

1 材料与方法

2 结 果

3 讨论

参考文献

第二部分HCN通道对培养的脊髓背角神经元ATP/P2X受体的调节作用

中文摘要

Abstract

1 材料与方法

2 结 果

3 讨论

参考文献

综述: HCN通道调节病理性疼痛的外周及中枢机制

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