金钗石斛多糖的结构鉴定及其乙酰化和硫酸化衍生物的生物活性研究

摘要

目的：金钗石斛多糖被证明是活性成分，但到目前为止其具体结构与相关活性研究仍然不是十分清楚。故深入的研究其结构与活性，将为金钗石斛基于多糖的物质基础及质量控制研究及其相关创新药物研究奠定基础。
　　方法：本课题对粗多糖的提取采用了沸水提取和酶联水提的两种方法。粗多糖经 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离纯化后，进一步运用凝胶柱Sephacryl S-100 HR纯化得到均一多糖。高效凝胶渗透色谱（HPGPC）用于测定多糖的纯度和分子量。PMP衍生法结合高效液相色谱（HPLC）和糖醇乙酸酯法结合气相色谱（GC）用于单糖组成测定。多糖的结构解析采用化学和仪器分析相结合的方法。包括FTIR、GC、GC-MS、甲基化、部分酸水解和核磁共振分析等。采用三氧化硫吡啶络合物对金钗石斛多糖JCS1进行硫酸化修饰，采用乙酸酐对金钗石斛多糖JCS1进行乙酰化修饰。PC-12细胞用于乙酰化金钗石斛多糖对神经细胞轴突的分化影响实验。人微血管内皮细胞（HMEC-1）用于评价细胞迁移和管腔形成实验。鸡胚绒毛尿囊膜实验用于多糖体内抗血管生成活性评价实验。
　　结果：金钗石斛的干燥茎经沸水提取后得到粗多糖JCS（47.96 g，产率1.20％）。JCS经分离纯化得到两种水溶性均一多糖JCS0（122.0 mg，产率0.25%）、JCS1（4.50 g，产率9.38%）和粗多糖JCS2（661.0 mg，产率1.38%）。JCS2经Sephacryl HR-100柱纯化得到均一多糖JCS2S1（174.5 mg，产率0.36%）。沸水提取后药材残渣经碱提取得到粗多糖JCN（4.03 g,产率0.08%），将JCN分离纯化得到均一多糖JCN1-1（151.0 mg，产率3.75%）。酶联水提后得到粗多糖AJCS（33.45 g，产率0.67%）。AJCS经阴离子交换柱DEAE Sepharose Fast Flow纯化得到两个组分AJCS1A（1.42 g，产率4.20%）和AJCS1B（1.20 g，产率3.60%）。AJCS1A经酶解后得到组分1AE（470.0 mg，产率33.10%），将1AE进一步分离纯化得到两种均一多糖1AE1（71.0 mg，产率15.10%）和1AE2（41.0 mg，产率8.75%）。AJCS1B经纯化得到均一多糖B1（117.0 mg，产率9.75%）。
　　高效凝胶色谱（HPGPC）分析表明JCS0、JCS1、JCS2S1、JCN1-1、1AE1、1AE2和B1的分子量分别为14.3 kD、12.3 kD、54.0 kD、20.3 kD、89.0 kD、37.1 kD和94.8 kD。而其中六种均一多糖JCS0、JCS1、JCN1-1、1AE1、1AE2和B1为中性多糖，JCS2S1为酸性多糖。JCS0由甘露糖和葡萄糖组成，其摩尔比为4.6:1.0。JCS1由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，其摩尔为40.2:6.1:4.8:2.9:1.9。JCS2S1含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其摩尔比为3.1:2.5:1.0:1.1:4.4:5.7:1.5。JCN1-1由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖组成，摩尔比为1.8:1.0:16.6:1.2:6.6。1AE1含有含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩尔比为1.0:4.3:1.0:2.4:25.6:17.3。1AE2含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩尔比为1.0:9.4:3.2:1.3:12.0:18.7。B1含有葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其摩尔比为1.0:1.9:1.5。对JCS1、B1和1AE2进行甲基化分析，确定了三种均一多糖的糖残基连接方式和摩尔比。分析结果为 JCS1含有1,4-Glcp，1,6-Glcp，T-Glcp，T-Galp，1,4,6-Glcp，1,4-Manp，1,4-Xylp，1,3,6-Glcp和T-Araf九种连接方式，其摩尔比为34.2:2.0:2.6:1.2:3.2:2.2:1.6:1.4:1.0。B1含有1,4-Glcp，1,6-Glcp，1,6-Galp，T-Glcp，1,3,6-Galp，1,3-Galp和 T-Araf七种连接方式，其摩尔比为3.7:5.5:1.3:1.0:6.2:4.0:7.3。1AE2含有1,6-Glcp，T-Glcp，T-Galp，1,3,6-Galp，1,3-Galp和T-Araf六种连接方式，其摩尔比为5.2:1.3:1.0:2.5:3.0:1.3。
　　对JCS1进一步的结构解析表明JCS1是以1,4-α-Glcp为主链，在其C-6有分支。研究发现支链是呈现三种不同的连接方式。第一种是在1,4-α-Glcp的C-6上连接1,6-β-Glcp，而1,6-β-Glcp的C-6与1,4-β-Manp相连，最后1,4-β-Manp的C-4位与T-α-Glcp相连。第二种则与第一种的连接方式相似，只是末端不是T-α-Glcp，而是有T-α-Galp组成。第三种连接方式则是在1,4-α-Glcp的C-6上连接1,3,6-β-Glcp，而在1,3,6-β-Glcp的C-3位连接1,4-α-Xylp，1,4-α-Xylp的C-4与T-α-Araf相连；在1,3,6-β-Glcp的C-6位连接的是T-α-Glcp。
　　对多糖的生物活性研究表明，JCS1的乙酰化衍生物YJCS1在低浓度（5.56μM）和高浓度（55.56μM）对PC-12细胞的神经轴突生长有促进作用。而JCS1的硫酸化衍生物JCS1S2在极低的浓度（0.2μM）能使人微血管内皮细胞（HMEC-1）管腔受到完全地破坏。此外该多糖对HMEC-1细胞的迁移也有明显的抑制作用。体内实验表明，硫酸化多糖JCS1S2能显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜上血管生成。
　　结论：从金钗石斛干燥茎中提取分离纯化出六种中性多糖（JCS0、JCS1、JCN1-1、1AE1、1AE2、B1）和一种酸性多糖（JCS2S1）。其中JCS1是1,4-α-D-Glcp为主链的半乳甘露葡聚糖。JCS1的乙酰化衍生物YJCS1对PC-12细胞神经轴突生长有促进作用。而JCS1的硫酸化衍生物JCS1S2对HMEC-1细胞的管腔形成、HMEC-1细胞的迁移和体内血管生成有良好的抑制作用。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

1金钗石斛的性状

2 金钗石斛的主要化学成分

3 多糖的衍生化

第一部分 金钗石斛多糖的提取、分离纯化

1 材料

2 方法

3 结果

4 小结

第二部分 金钗石斛多糖的结构解析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论与小结

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论与小结

1 材料

2 方法

3 实验结果

4 讨论与小结

本论文总结

1. 本论文主要研究成果

2. 本论文的创新点

参考文献

综述:金钗石斛多糖研究进展

致谢

作者简介

附图