海洋嗜热菌的筛选、热稳定脂肪酶性质及其热适应机理研究

摘要

史前地球表面的一个特点是高温炎热，因此嗜热性是一种原始生命的特性。生物的一个基本特征是对环境的适应性，微生物作为地球上最早形成的第一类生命体征，对高温的适应能力尤为惊人。可以想象在地球表面温度逐渐降低的过程中会出现各种各样的嗜温细菌，嗜热细菌则可能是嗜温细菌适应高温环境的产物。 鉴于嗜热菌在基因工程、蛋白质工程、发酵工程及矿产资源的开发利用上均有很大的应用价值和开发前景，近些年来国内外科研人员都对嗜热菌的研究展示了极大兴趣。 本论文从太平洋深海热液区和厦门近海温泉分离到50株嗜热菌，进一步对它们的产脂肪酶能力进行了筛选，其中TW-1产脂肪酶能力最强。在16S rDNA鉴定的基础上，TW-1归属为Gebacillus sp.。随后，对TW-1菌的脂肪酶基因进行了克隆及在Escherichia coli中的表达。结果表明，该酶基因长1254bp，编码417个氨基酸。重组脂肪酶的最适反应温度在40℃左右，在90℃时约有10％酶活。重组脂肪酶的最适pH值在7-8，在pH6.0-9.0范围内保留80-100％的活性。该酶在1mM的变性剂(EDTA，2-ME，SDS，PMSF或DTT)和0.1％的去污剂(Tween 20，Chaps或Triton X-100.)作用下，EDTA、2-ME、SDS可以抑制大约18-30％的重组脂肪酶及粗酶活性，DTT和PMSF对酶活基本无影响。0.1％Tween 20、Chaps和的TritonX-100对粗酶酶活几乎无什么影响，而对重组脂肪酶的酶活有5-10％的抑制。在ImM或5mM的Ca2+，Mg2+，Zn2+，I mM的Fe2+and Fe3+作用下，酶活均增强到了103-283％，1 mM的LiCI，CuCl2或MnCl+对酶活有轻微的抑制，5 mM的CuCl2或MnCl2作用下完全测不到酶活。Fe2+，Fe3+形成沉淀，无法测定脂肪酶活性。本研究提供了一种快速、有效、大量获取高温脂肪酶的方法，在工业上具有广泛应用前景。 为了探索嗜热菌的热适应性机理，本文以近海温泉分离获得的Thermusthermophilus WL为材料，采用蛋白质组学进行研究。根据已测序T.thermophilus的基因组序列，建立其开放阅读框(ORF)数据库。通过不同温度下全菌蛋白的SDS-PAGE及Trieine-SDS-PAGE电泳发现，图谱以最适生长温度(70℃左右)为分界线呈两种带型，低于最适生长温度为一种带型，等于或高于生长温度为另一种带型。将其中ll条差异明显的条带进行质谱鉴定，在ORF数据库比对后获得相应的基因。为了寻找更多与热适应性相关的蛋白，进一步采用双向电泳对55℃75℃两个温度下的全菌蛋白样品进行分析，将75℃条件下蛋白表达量明显上调的10个点进行质谱鉴定。通过蛋白质组学分析，共有17种蛋白在高温下上调表达。对差异表达蛋白相应的基因进行标记，采用Northem blot检测基因转录量，结果17种基因均明显上调表达，与蛋白电泳图谱结果一致。对高温差异表达的超氧化物岐化酶、延胡索酸水化酶、转录与释放因子基因进行重组表达及抗体制备后，利用Western blot进行验证，结果可检测到3种基因的表达产物。Northem blot和Western blot分析证实了蛋白质组学的分析结果。 从17个基因中选择SOD进行基因功能研究，利用基因插入失活手段将耐高温的卡那霉素编码基因插入SOD基因中间，构建SOD突变株。通过含卡那霉素平板在65℃下筛选突变株，获得SOD基因失活的突变株。提取突变株基因组DNA，经PCR检测正确后，PCR产物进行测序分析，结果表明构建的突变株正确。标记卡那霉素编码基因，对突变株进行Northern blot，结果发现卡那霉素基因有转录产物；以SOD特异的抗体进行Western blot分析，结果SOD突变株中检测不SOD。在上述试验证实SOD突变株正确的前提下，测定突变株的生长曲线。结果显示，突变株与野生型菌株相比，最适生长温度下降，最高生长温度也下降Ts

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1嗜热菌概述

1.2嗜热菌应用

1.3嗜热菌耐热性的研究进展

1.3.1膜的耐热性研究

1.3.2核酸的耐热性研究

1.3.3蛋白质的耐热性研究

1.4蛋白质耐热性研究进展

1.4.1蛋白质耐热性的研究手段

1.4.2蛋白质耐热性的研究范围

1.4.3蛋白质热稳定的分子机制和结构分析

1.5脂肪酶的研究进展

1.5.1脂肪酶的结构

1.5.2脂肪酶的应用领域

1.5.3脂肪酶的生产

1.5.3脂肪酶活力的测定方法

1.5.4脂肪酶的工程改造

1.5.5未来脂肪酶的发展方向

1.6本论文研究的内容和意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1样品

2.1.2菌株和质粒

2.1.3主要试剂

2.1.4主要仪器

2.1.5引物

2.1.6主要分析软件

2.1.7培养基及主要溶液

2.2基本方法

2.2.1细菌染色体总DNA的提取

2.2.2 PCR反应

2.2.3菌落PCR

2.2.4 DNA片段回收

2.2.5连接反应

2.2.6化学感受态细胞的制备

2.2.7化学转化方法

2.2.8质粒少量制备

2.2.9 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳、染色、脱色

2.2.10核酸内切酶酶切反应

2.2.11重组质粒表达的小量检测

2.2.12重组蛋白可溶性的确定

2.2.13 Glutathi one Sepharose 4B纯化重组蛋白

2.2.14酶联免疫分析(ELISA)

2.2.15 DNA探针的DIG标记

2.2.16细菌总RNA的提取

2.2.17细菌总RNA的纯化

2.2.18革兰氏染色

2.2.19 Tricine-SDS-PAGE

2.2.20嗜热菌的筛选及热稳定脂肪酶基因的克隆与分析

2.2.21抗血清的纯化

2.2.22蛋白的western blot印迹杂交

2.2.23 Northern blot印迹杂交

2.2.24蛋白双向电泳(two-dimensional electrophorese)

2.2.25免疫共沉淀

2.2.26嗜热菌电转化方法

3结果与分析

3.1嗜热菌的筛选及热稳定脂肪酶的性质研究

3.1.1嗜热菌的分离与鉴定

3.1.2热稳定脂肪酶的性质研究

3.2嗜热菌的热适应机理初步研究

3.2.1 T.thermophilus WL热适应相关蛋白的蛋白质组学分析

3.2.2高温差异表达蛋白编码基因的转录与表达分析

3.2.3 SOD基因的热适应性功能研究

3.2.4蛋白相互作用分析

4讨论

4.1嗜热菌的筛选与鉴定

4.2热稳定脂肪酶的研究

4.3嗜热菌的热适应机理研究

5结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

附录

致谢