环孢菌素A联合苦参碱逆转K562/ADM细胞多药耐药的研究及微流控芯片检测药物外排的应用

摘要

目的：本课题旨在研究环孢菌素A(CsA)及苦参碱(MAT)单独及联合应用对人慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞株K562及其耐阿霉素(ADM)细胞株K562/ADM糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表达的影响，以探讨它们逆转多药耐药(MDR)的作用机理，为环孢菌素A和苦参碱作为耐药逆转剂的临床应用提供理论依据。并探讨微流控芯片在检测白血病耐药细胞株药物外排功能中的应用前景，为临床逆转MDR的药物筛选提供新的策略和方法。 方法：实验组分为下列几组：(1)K562/S敏感细胞组：(2)K562/ADM耐药细胞组；(3)K562/ADM+CsA组；(4)K562/ADM+MAT组；(5)K56Z/ADM+CsA+MAT组。MTT法测定逆转剂环孢菌素A或/和苦参碱的细胞毒性及药物作用后的逆转倍数，流式细胞术测定细胞凋亡百分率的变化，以评价环孢菌素A、苦参碱单独及联合与阿霉素共同作用情况下对K562/ADM阿霉素耐药的逆转效果。荧光分光光度法、流式细胞仪(FCM)检测细胞内药物(ADM)浓度的改变，微流控芯片检测白血病耐药细胞株药物外排。免疫组化法检测MDR-1基因编码的P-gp表达变化，流式细胞术定量检测P-gp变化，以探讨环孢菌素A及苦参碱逆转MDR机制与P-gp介导的药物转运能力改变之间的关系。 结果：1.环孢菌素A和苦参碱对K562/5及K562/ADM均有明显的抑制作用，且IC50接近，无统计学差异(P>0.05)。非细胞毒性剂量的两药联合应用后未出现毒性叠加，以环孢菌素A及苦参碱对K562/ADM细胞的非细胞毒性剂量作为最佳的逆转浓度；2.在与ADM合用时，K562/ADM+CsA组及K562/ADM+MAT组的IC50均低于K562/ADM耐药组(P<0.01)，但高于K562/ADM+CsA+MAT组(P<0.01)，二药联合应用时逆转倍数大于两者单独作用之和。与Annexin v-FITC流式细胞术检测的细胞凋亡百分率增加是一致的；3.K562/ADM+CsA组、K562/ADM+MAT组和K562/ADM+CsA+MAT组，细胞内ADM浓度明显增加，与K562/ADM对照组间有显著性差异(P<0.01)。微流控芯片检测结果和FCM法的结果基本一致；4.免疫组化法的结果显示，与K562/S比较，K562/ADM细胞中P-gp呈高表达；5.与K562/ADM耐药组比较，K562/ADM+MAT组P-gp表达量降低(P<0.01)，而K562/ADM+CsA组P-gp表达量无明显变化(P>0.05)，但两者联合应用时作用大于两者单独作用之和。 结论：1.环孢菌素A和苦参碱均是有效的抗肿瘤药，且K562/ADM对其不具耐药性，非细胞毒性剂量的两药联合时无毒性的叠加；2.非细胞毒性剂量的环孢菌素A和苦参碱均可部分逆转有多药耐药表型的细胞株K562/ADM对阿霉素的耐药性，二者联合应用效果优于单独应用，具有协同作用；3.微流控芯片检测白血病耐药细胞株药物外排的方法具有一定可行性，在MDR逆转药物的筛选和肿瘤个体化治疗方面有良好的应用前景；4.K562/ADM细胞中多药耐药基因MDR-1编码的P-gp过度表达可能是引起K562/ADM细胞产生MDR的主要原因；5.环孢菌素A与苦参碱联合用于逆转MDR时，主要机制可能是通过下调P-gp的表达。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1白血病的多药耐药性及其机制

1.2白血病多药耐药的干预对策

1.3微流控芯片技术在生物学中的应用

1.4本文研究的目的与意义

2材料与方法

2.1材料

2.2常用溶液、培养基的配制

2.3主要仪器

2.4基本方法

2.4.1细胞培养及实验分组

2.4.2 MTT法测定CsA与MAT的细胞毒性及耐药细胞的耐药倍数

2.4.3 MTT法测定细胞的药敏性

2.4.4 Annexin v-FITC流式细胞仪术检测耐药细胞的凋亡百分率

2.4.5荧光分光光度法检测逆转剂对细胞内药物(ADM)浓度的影响

2.4.6玻璃微流控芯片的制作

2.4.7 P-gp外排功能的微流控芯片检测

2.4.8 P-gp外排功能的流式细胞仪测定

2.4.9免疫组化法检测P-gp表达

2.4.10流式细胞术检测细胞的P-gp表达变化

2.4.11细胞冻存

2.4.12统计学处理

3结果与讨论

3.1结果

3.1.1 K562/ADM细胞多药耐药的逆转

3.1.2药物外排的检测

3.1.3 CsA和MAT联合逆转K562/ADM细胞耐药机制的探讨

3.2讨论

4结论

5展望

6参考文献

7致谢