脑通汤对轻度血管性痴呆治疗作用及机制探讨

摘要

目的:
　　1)探讨脑通汤免煎颗粒治疗轻度血管性痴呆（气虚血瘀证）的临床疗效。
　　2)通过观察脑通汤对缺氧/缺糖损伤后海马星形胶质细胞Nf-kB信号通路介导的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达和Nf-kB分泌的干预作用，探讨海马星形胶质细胞的抗炎机制。
　　3)通过观察脑通汤对缺氧/缺糖损伤后海马星形胶质细胞Nrf2/ARE信号通路介导的抗氧化酶HO-1、NQO1基因表达和Nrf2分泌的干预作用，探讨海马星形胶质细胞的抗氧化机制。
　　4)通过观察脑通汤对缺氧/缺糖损伤后海马星形胶质细胞BDNF及其受体TrkB基因表达和BDNF分泌的干预作用，探讨海马星形胶质细胞对NVU的保护机制。
　　方法:
　　1)按标准将符合轻度血管性痴呆的56例患者随机分为治疗组（28例）和对照组（28例），治疗纽采用脑通汤免煎颗粒治疗;对照组采用安理申治疗，两组治疗均为期6个月。观察分析治疗前后的MMSE、ADL积分及中医症状积分变化，运用尼莫地平疗效判定标准评定临床疗效，并观测实验药物的安全性。
　　2)通过海马星形胶质细胞原代培养、鉴定以及制备脑通汤含药血清，为下一部实验的进行做准备。采用缺氧/缺糖方式进行造模，然后MTT比色法测定海马星形胶质细胞缺氧缺糖24h复氧复糖2h时间点的活性剂存活率;将海马星形胶质细胞随机分为6组，分别为:正常细胞组、模型组、正常血清组、大、中、小剂量脑通汤含药血清组。除正常细胞组外，其余各组均进行缺氧/缺糖处理，其中含药血清组提前添加含药血清进行干预。缺氧/缺糖处理厉通过实时荧光定量PCR法检测海马星形胶质细胞Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA;Nf-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA;BDNF、TrkBmRNA的基因表达;通过ELISA检测海马星形胶质细胞Nrf2、Nf-κB、BDNF的分泌。
　　结果:
　　1)治疗组与对照组药物均能明显改善VD患者的认知功能、日常生活能力及中医症候，而且治疗组疗效与对照组相比无明显差异。结果表明脑通汤免煎颗粒在改善患者认知功能、日常生活能力和中医临床疗效方面疗效显著，而且脑通汤免煎颗粒在改善患者上述各方面能力与西药安理申无明显差异。用药过程中，治疗纽无明显不良反应，安全性良好。
　　2)经过海马星形胶质细胞原代培养、鉴定及制备脑通汤含药血清，本实验成功获得了海马星形胶质细胞以及脑通汤含药血清，为下一步实验奠定了基础。经过MTT比色法发现24h和2h为本实验的最佳缺氧缺糖和复氧复糖时间点。海马星形胶质细胞实时荧光定量PCR显示:与正常细胞组比较，模型纽Nrf2、HO-1、NQO1、Nf-κ B、TNF-α、IL-1β、IL-6的相对表达量表达明显升高(P＜0.05)，而模型组BDNF、TrkBmRNA的相对表达量表达明显降低。与模型组比较，不同剂量脑通汤含药血清组Nrf2、HO-1、NQO1、BDNF、TrkB mRNA的相对表达量表达明显升高(P＜0.05)，而Nf-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的相对表达量表达明显降低(P＜0.05)。但正常血清组与模型组比较上述各种基因表达均无显著差异(p＞0.05)。ELISA检测Nrf2、Nf-κ B、BDNF蛋白的变化情况与其相应mRNA具有一致性。
　　结论：
　　1)脑通汤免煎颗粒能明显改善轻度血管性痴呆气虚血瘀证患者临床症状，提高临床疗效，为临床治疗轻度血管性痴呆气虚血瘀证患者提供了有效制剂。
　　2)缺氧/缺糖模型能很好的模拟海马星形胶质细胞脑缺血再灌注损伤。脑通汤对缺氧/缺糖损伤的海马星形胶质细胞的抗炎、抗氧化具有调节作用，且能增强星形胶质细胞对整个NUV的保护作用。其作用机制，与本方能抑制缺氧/缺糖损伤时由Nf-kB信号通路介导的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的基因表达以及Nf-kB分泌，减轻其介导的炎症反应有关;与本方能上调缺氧/缺糖损伤由Nrf2/ARE信号通路介导的抗氧化酶HO-1、NQO1的基因表达以及Nrf2分泌，对抗氧化应激对星形胶质细胞的损伤有关;与本方能上调缺氧/缺糖损伤BDNF及其受体TrkB的基因表达以及BDNF分泌，发挥保护NVU的作用有关。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 临床研究

1 临床资料

2 诊断标准

3 研究方法

4 观察指标及观测时间

5 临床疗效及安全指标评价

6 统计学方法

7 结果

8 讨论

第二部分 实验研究

第一章 大鼠海马星形胶质细胞的原代培养鉴定

1 实验材料与仪器

2 实验方法与结果

3．结论与讨论

第二章：脑通汤含药血清的制各

1．实验材料与仪器

2 试验方法与结果

3 结论与讨论

第三章 MTT法测定缺氧／缺糖海马星形胶质细胞活性并计算存活率

1 实验材料与仪器

2．实验方法与结果

3 结论与讨论

第四章 海马神经元缺氧／缺糖模型的建立

1．实验材料和仪器

2 实验方法与结果

3 结论与讨论

第五章 脑通汤对缺氧／缺糖损伤海马星形胶质细胞Nrf2mRNA、HO-1mRNA、NQO1mRNA基因表达以及对Nrf2分泌的影响

第一节 脑通汤对缺氧／缺糖损伤海马星形胶质细Nrf2mRNA、HO-1mRNA、NQO1mRNA基因表达的影响

第二节 脑通汤对缺氧／缺糖损伤海马星形胶质细Nrf2分泌的影响

第六章 脑通汤对缺氧／缺糖损伤海马星形胶质细胞Nf-kBmRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA基因表达以及对Nf-K B分泌的影响

第一节 脑通汤对缺氧／缺糖损伤海马星形胶质细Nf-kBmRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA基因表达的影响

第二节 脑通汤对缺氧／缺糖损伤海马星形胶质细Nf-κB分泌的影响

第七章 脑通汤对缺氧／缺糖损伤海马星形胶质细胞BDNFmRNA、TrkBmRNA基因表达以及对BDNF分泌的影响

第一节 脑通汤对缺氧／缺糖损伤海马星形胶质细BDNFmRNA、TrkBmRNA基因表达的影响

第二节 脑通汤对缺氧／缺糖损伤海马星形胶质细BDNF分泌的影响

总结与展望

参考文献

附录一 英文缩略词简表

附录二 血管性痴呆的中西医研究进展

附录三 海马星形胶质细胞原代培养及鉴定图片

附录四 海马星形胶质细胞的RNA鉴定图及基因扩增曲线图

附表