Brg1在正常与疾病状态下眼表组织中的表达与功能研究

摘要

背景:Brahma相关基因1（Brahma-related gene1，Brg1）是染色质重塑复合物SWI/SNF的ATP酶亚基之一，广泛存在于真核细胞中。以往的研究表明，Brg1结合复合物参与不同类型细胞的细胞周期控制、凋亡和细胞分化。到目前为止，没有关于眼表上皮细胞Brg1表达以及功能的报道。
　　方法:对小鼠、兔以及人眼表组织的Brg1表达和定位进行免疫荧光染色和蛋白质印迹检测。人角膜上皮细胞株(HCE)，小鼠角膜上皮细胞系(TKE2)，小鼠原代培养的角膜上皮细胞(mCEC)分别在DMEM/F12+10％FBS，KSFM，和CNT-20培养基中培养。兔角膜缘上皮细胞进行克隆培养。采用0.9mM Ca2+，10％FBS或Brg1 siRNA处理TKE2，探讨Brg1在角膜上皮细胞分化中的作用。另外，对翼状胬肉组织的Brg1表达进行免疫荧光染色及PCR检测。
　　结果:在小鼠出生后第0-7天，角膜上皮未见Brg1表达，第2周开始在角膜上皮基底层有少量细胞表达，第3周见阳性细胞扩展至基底上层，至第4周中央角膜上皮呈全层表达。角膜缘处均无表达。Brg1在人角膜缘上皮细胞基底层无表达，而在角膜缘上层、外周和中央角膜上皮细胞全层表达。在兔角膜缘和角膜组织中，Brg1呈现类似的表达模式。免疫荧光染色显示，TKE2细胞系、HCE细胞系和mCEC细胞核中均有Brg1表达，但在核中的表达分布不同。兔角膜缘上皮细胞克隆未见Brg1表达，而在原代培养的兔角膜缘上皮细胞和兔中央角膜上皮细胞中，Brg1均呈核表达。TKE2在0.9mM Ca2+或10％FBS诱导分化后，细胞中Brg1表达水平没有明显改变，但在细胞核中的分布方式发生变化。TKE2细胞转染Brg1 siRNA后，经过实时荧光定量PCR检测发现，Brg1表达水平下降，而p63、K14等干细胞特异性蛋白表达水平增高，同时与上皮细胞分化相关的转录因子Klf4表达水平降低。人及兔正常结膜组织只在上皮表层有少量Brg1表达，但翼状胬肉上皮层全层细胞高表达Brg1。
　　结论:Brg1可能与角膜上皮细胞的成熟和分化有关;也可能参与翼状胬肉的发生发展过程。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 Brg1概述

1．1．1 Brg1概念

1．1．2 Brg1的生物学作用

1．2 Brg1对干细胞的影响

1．2．1 Brg1对胚胎干细胞的影响

1．2．2 Brg1对成体干细胞的发育和分化的影响

1．3 Brg1在肿瘤发生中的作用

1．4 技术路线

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要仪器

2．1．2 主要试剂

2．1．3 常用试剂配制

2．2 实验内容与方法

2．2．1 免疫荧光

2．2．2 细胞培养

2．2．3 TKE2细胞转染(GenePharma siRNA-MateTM试剂盒说明书)

2．2．4 RNA含量的测定

2．2．5 蛋白质含量的测定

第三章 结果

3．1 Brg1在角膜上皮中的表达

3．1．1 Brg1在角膜上皮发育中的表达

3．1．2 Brg1在成体眼表上皮组织中的表达情况

3．1．3 Brg1在眼表上皮细胞中的表达情况

3．1．4 Brg1在角膜上皮细脆分化中的作用

3．2 Brg1在翼状胬肉中的表达

第四章 讨论

4．1 Brg1在角膜上皮细胞分化中的作用

4．1．1 Brg1在角膜上皮成熟过程中的表达

4．1．2 Brg1在角膜上皮分化过程中的表达

4．2 Brg1在翼状胬肉的发生发展中的作用

第五章 结论

第六章 问题与展望

参考文献

附录

硕士在学期间主要科研成果

致谢