神经细胞特异性Cre重组酶表达载体的构建及其体外表达研究

摘要

Cre-10xP系统介导的条件性基因敲除(conditional gene knockout)是基因功能研究最重要的技术之一，它克服了传统基因敲除导致小鼠胚胎死亡等诸多弊端。将该技术应用于神经系统，可使基因敲除仅发生于大脑的某个亚区或发育过程的某个阶段，以便对小鼠大脑基因功能进行精细研究。对于神经系统条件性基因敲除而言，选择一个大脑亚区和时间特异性启动子指导Cre的表达是至关重要的。许多研究表明，CaMKII α基因的表达具有较强的时间和空间特异性，因此，符合制备前脑神经细胞特异性表达Cre转基因小鼠的要求。 本研究通过克隆和鉴定CaMKII-α基因5’端不同调节区的序列，构建了两个神经细胞特异性表达Cre的真核表达载体，并对这两个载体的转录活性进行了初步研究。为建立前脑神经细胞特异性表达Cre的转基因小鼠及进一步制备ADAM10基因条件性敲除的小鼠墓定了基础，有助于开展阿尔茨海默病发病机制的研究。 运用PCR技术，从C57BL/6J小鼠基因组中分步扩增了CaMKII α基因5’端两段调控序列，长度分别为5.26kb和8.1kb。经部分测序鉴定后，将片段分别连接于pCre-EGFP载体的Cre基因上游，构建了神经细胞特异性表达Cre重组酶的表达载体pCaMK II α-Cre-EGFP I(pCCE I)和pCaMKII α-Cre-EGFPII(pCCE II)。取C57BL/6J新生鼠与4周龄小鼠的端脑与海马进行神经元的原代培养。分别以pCCE I和pCCEII为实验组，pCre-EGFP为阳性对照组，采用脂质体2000(LP2000)转染神经细胞、小鼠神经瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞(NGl08-15)和人乳腺癌细胞(ZR一75-30)，研究pCCE I和pCCE II的表达活性及其组织特异性。 结果: 显示，克隆的两个CaMKII Q基因5’端侧翼区片段的酶切图谱与公布的C57BL/6J小鼠相应序列的酶切位点相一致，测序结果表明，所测序列与数据库公布的C57BL/6J小鼠相应序列基本相同，仅在-940bp(A-C)和-1.4kb(A-G)两处存在差异。其中，文献报道的富含顺式调控元件的-900bp内序列与公布的C57BL/6J小鼠序列完全一致。5.26kb与8.1kb这两段CaMK Ⅱα基因启动子均正确地连接于Cre基因的5’端，成功构建了目标载体。新生鼠神经细胞的原代培养表明，细胞数量多(35mm培养皿中细胞密度兰10≥106/cm3)，细胞形态好。4周龄鼠神经细胞的原代培养细胞形态较典型，但细胞数量很少(35mm培养皿中细胞不超过300个)。用LP2000转染后，在NG108-15细胞中，pCCEI组能表达绿色荧光(表达率低)，pCCE II组不表达绿色荧光，阳性对照组表达绿色荧光；在ZR一75-30细胞中，pCCE I组和pCCE II组都不表达绿色荧光，阳性对照组表达绿色荧光；在新生鼠神经细胞中，pCCE I组和pCCE II组都不表达绿色荧光，阳性对照组表达绿色荧光(转染效率低)；在4周龄鼠神经细胞中，由于细胞数量少，培养困难，经L22000处理后即发生死亡，故实验组与阳性对照组均未表达绿色荧光。 综上所述，得出以下 结论： 本研究成功构建并鉴定了神经细胞特异性Cre表达载体(pCCE I和pCCEII)。成功培养了新生鼠与4周龄鼠的皮质及海马神经细胞。pCCE I能在神经细胞瘤一神经胶质瘤细胞NG108-15中表达绿色荧光，说明pCCE I的启动子CaMKIIαQ基因5.26kb片段具有启动转录的活性；pCCE I和pCCE II在人乳腺癌细胞ZR一75-30中不表达，支持了其表达的神经细胞特异性；pCCE I和pCCE II在新生鼠神经细胞中不表达，一定程度上支持了其表达的时间特异性。pCCEII中包含的CaMKIIα基因几乎所有调控区的8.1kb片段的转录活性尚有待体内实验的证实。实验结果证明本研究所构建的神经细胞特异性表达Cre的转基因载体pCCE I具有转录活性，且支持其表达的时空特异性。理论上证明了建立前脑神经细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的可行性。

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结论

参考文献

综述 神经系统条件性基因敲除研究进展

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