四环素诱导的Cre重组酶表达载体的构建及其体外表达研究

摘要

Cre/loxP系统介导的条件性基因敲除(conditional gene knockout)克服了传统基因敲除的诸多弊端，是基因功能研究的最重要的技术之一。在此基础上，Cre/loxP系统与Tet基因表达系统相结合建立起的诱导性条件性基因敲除技术，能够更精确地研究基因的功能。该技术需要制备两种遗传工程小鼠，一种是时间特异性可诱导表达Cre的转基因小鼠，另一种是目的基因片段两侧带有同向loxP位点的基因打靶小鼠，通过两种鼠系的杂交，可实现可诱导性的时间特异性的基因敲除。 本研究构建和鉴定了两个诱导表达Cre的真核表达载体，并对这两个载体的转录活性进行了初步研究，为建立诱导性表达Cre的转基因小鼠及进一步制备条件性ADAM10基因敲除的小鼠奠定了基础，有助于开展ADAM10基因功能的研究。 采用分子生物学技术，将Tet-On基因表达系统的pTRE载体线性化，并与pCre-IRES-EGFP质粒中长约2.7kb的片段连接，构建成重组质粒pTRE-Cre-EGFP(P1)。将P1与Tet-On基因表达系统中的另一载体pTet-On共转染293T细胞，加入或者不加强力霉素(Doxycycline，Dox)，观察绿色荧光和Cre重组酶基因的表达。切下P1载体的部分片段Phcmv-Cre-EGFP与pTet-On载体的部分片段Pcmv-rtTA连接成Pcmv-rtTA-EGFP-Cre-Phcmv(P2)载体，将其转染入293T细胞，加入或者不加Dox诱导，对照观察绿色荧光和Cre重组酶基因的表达。P1与pTet-On的共转染及P2载体的单转染均以pCre-IRES-EGFP为阳性对照组，分别对诱导表达出的Cre重组酶基因进行RT-PCR鉴定。 结果显示，经酶切和测序鉴定，成功构建了P1和P2载体。采用脂质体LP2000将P1与pTet-On质粒共转染293T细胞后，不加Dox时，没有或者很少表达绿色荧光；阳性对照组表达绿色荧光。而加入Dox后，P1与pTet-On质粒共转染的细胞诱导表达出绿色荧光：转染48小时后，分别提取其RNA，经RT-PCR检测表明，诱导表达出绿色荧光的细胞，均能检测出Cre基因的表达；反之，则检测不出Cre基因的表达，证实了绿色荧光和Cre基因的表达是一致的。 采用LP2000将P2转染293T细胞后，不加Dox时，没有绿色荧光的表达，阳性对照组表达绿色荧光，而加入Dox后，P2的转染能诱导表达绿色荧光；转染48小时后分别提取其RNA进行RT-PCR检测，诱导表达出绿色荧光时均能从mRNA水平上检测出Cre基因的表达；反之，则检测不出Cre基因的表达。 综上所述，得出以下结论： 本研究成功构建并鉴定了诱导性表达Cre重组酶的载体(P1和P2)。P1和pTet-On质粒的共转染能在293T细胞中诱导表达绿色荧光，并能从mRNA水平上检测出Cre基因的表达。P2的转染也能在293T细胞中诱导表达绿色荧光，并能从mRNA水平上检测出Cre基因的表达。实验结果证明，本研究所构建的诱导性表达Cre的载体P1和P2均能以时间特异性的方式诱导表达Cre重组酶基因，从细胞水平上证实了P1和P2载体的基因元件在体外均能发挥正常的功能，可以用于制备诱导性表达Cre重组酶的转基因小鼠。而且，使用P2载体仅需制备一种转基因小鼠就能满足研究的需要。

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材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 四环素诱导的基因表达系统研究进展

附录

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