SnoN蛋白在RPE细胞TGF-β/Smad信号通路中的作用

摘要

近视是目前全球发生率最高的屈光不正，并且呈逐年上升的趋势，在亚洲部分国家和地区特定人群中尤为显著，其发病机制尚不清楚。视网膜–视网膜色素上皮–脉络膜信号转导系统在近视发病机制中的作用成为眼科研究的热点。
　　转化生长因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β)/Smad信号通路具有调节细胞生长、分化、凋亡、迁移和侵袭转移等多种功能，也是近视眼发病机制研究的重要信号通路之一。近期研究发现 Smad核转录共抑制因子(Ski-related Protein N，SnoN)在糖尿病肾病大鼠肾脏组织中可调节通路信号的传递，SnoN的表达水平在很大程度上影响 TGF-β的生物学效应，是TGF-β/Smad信号通路中重要的细胞因子。目前，人视网膜色素上皮细胞上是否有SnoN蛋白的存在及其在TGF-β/Smad信号通路中的作用尚不清楚。
　　目的：本实验中检测了SnoN蛋白在人视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞中的表达，和人重组TGF-β1（rh TGF-β1）作用下ARPE-19细胞内SnoN含量的变化，探讨核转录共抑制因子SnoN蛋白在ARPE-19细胞中表达水平及其在TGF-β/Smad通路中可能的作用。
　　方法：在ARPE-19细胞上，用免疫荧光法（Immunofluoresent Assay，IFA）检测细胞中 SnoN蛋白的表达水平以及表达部位；用不同浓度 rh TGF-β1（0ng/ml，1ng/ml，2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml）、相同时间点（2h）和相同浓度 rhTGF-β1（5ng/ml）、不同时间点（0min，30min，1h，2h，3h，6h，12h，24h，48h）干预ARPE-19细胞后，分别提取RNA和蛋白质，实时荧光定量 PCR法（Real-time Fluorescent Quantitation Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR）检测SnoN的mRNA表达水平的差异性；用蛋白免疫印迹（Western-Blot）法检测SnoN蛋白表达水平的差异性。
　　结果：①免疫荧光结果显示SnoN蛋白在ARPE-19细胞中有表达，且主要位于胞浆中；②不同浓度rhTGF-β1（0ng/ml，1ng/ml，2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml）作用于ARPE-19细胞2h后，与空白对照组相比，各处理组SnoN的mRNA表达量水平显著增高，明显高于对照组（P<0.05）。然而，SnoN蛋白表达水平无统计学差异（P>0.05）；③在相同浓度rhTGF-β1（5ng/ml）、不同时间点（0min，30min，1h，2h，3h，6h，12h，24h，48h）作用于RPE细胞后，与空白对照组相比，30min组SnoNmRNA表达量下降，但差异无统计学意义（P>0.05），其余各处理组 SnoNmRNA表达量均上升，且差异有统计学意义（P<0.05）。然而，SnoN蛋白表达水平无统计学差异（P>0.05）。
　　结论：SnoN蛋白在ARPE-19细胞中有表达，且可能在RPE细胞TGF-β/Smad信号通路中具有被调控的作用。

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前言

材料和方法

1 材料

1.1 实验细胞

1.2 实验用仪器设备

1.3 实验用试剂与耗材

1.4 实验用溶液的配制

2方法

2.1 细胞复苏与传代培养

2.2 免疫荧光法检测SnoN蛋白在ARPE-19细胞中的表达水平、表达部位

2.3 实时荧光定量RT-PCR法检测SnoN mRNA在ARPE-19细胞中表达水平的差异

2.4 Western印记法检测SnoN蛋白在ARPE-19细胞中表达水平的差异

3 统计学处理

结果

1 免疫荧光技术检测结果

2 实时荧光定量PCR检测结果

3 Western-Blot检测结果

讨论

1 近视与视网膜及其色素上皮细胞

2近视与TGF-β/Smad信号通路

3 TGF-β/Smad信号通路与SnoN蛋白

4问题与展望

结论

参考文献

综述:TGF-β/Smad信号通路与近视及SnoN蛋白

致谢