Aspergillus tamarii FS132脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

摘要

本研究从新疆火焰山土样中分离到一株脂肪酶产生菌FS132，对其进行18SrRNA分子标记鉴定，进一步克隆了该菌脂肪酶基因(ATL)，并实现了该脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达，为深入研究Aspergillus tamarii脂肪酶合成的分子机理奠定了基础，也为改造现有脂肪酶提供新的脂肪酶基因资源。主要研究内容及成果如下： (1)从新疆火焰山口土样中分离的一株脂肪酶产生菌FSl32，菌落形态表明为霉菌。克隆测定了该菌18S rRNA基因序列，并将该序列进行比对和聚类分析，构建系统进化树。结果表明该菌与报道的 Aspergillus tamarii具有最紧密亲缘关系。 (2) ATL 基因及其cDNA的克隆和序列分析：分别提取Aspergillus tamarii FS132基因组DNA和总RNA，根据资料，利用Aspergillus tamarii亲源关系较近的脂肪酶基因序列设计引物，采用PCR、RT-PCR等技术扩增了FS132脂肪酶基因(ATL)和全长cDNA序列。ATL-cDNA全长由921个碱基组成；PCR扩增获得的ATL-DNA由1742个碱基组成，包括ATL编码区，3'非翻译区和5'非翻译区基因的序列，其中ATL编码区有1024个碱基，含有2个内含子，大小分别为51 bp、52 bp。 (3) 为了验证所克隆到的ATL-cDNA序列的功能，构建重组表达载体，以毕赤酵母GS115为宿主进行功能表达分析。表达菌株经0.5％甲醇诱导培养，实现了Aspergillus tamarii FS132脂肪酶蛋白的分泌表达。经SDS-PAGE分析结果表明，重组酵母分泌36.7 kD左右的重组蛋白；三丁酸甘油酯检验板中出现水解圈；NaOH滴定法测定表明发酵液脂肪酶活力为20U/mL。 (4) 初步优化了 Aspergillus tamarii FS132发酵产酶条件，产酶最适培养时间为45 h，培养基最适初始pH 7.0，最适培养温度36℃，最适摇瓶空气量25 mL/250 mL锥形瓶。

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摘要

中文文摘

第1章绪论

1.1微生物脂肪酶简介

1.2微生物脂肪酶的分子生物学研究进展

1.2.1细菌脂肪酶分子生物学研究概况

1.2.2真菌脂肪酶分子生物学研究概况

1.2.3微生物脂肪酶分子改造研究进展

1.3本课题研究的目的和意义

1.3.1目的

1.3.2意义

第2章脂肪酶产生菌Aspergillus sp.FS132 18S rRNA基因序列分析

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果与讨论

2.3.1 Aspergillus sp.FS132形态学观察

2.3.2Aspergillus sp.FS132 18S rRNA基因的获得

2.3.3阳性克隆子的筛选与验证

2.3.4 18S rRNA基因序列及系统进化树分析

2.4小结

第3章Aspergillus tamariiFS132脂肪酶基因组DNA(ATL-DNA)及cDNA(ATL-DNA)序列分析

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3结果与讨论

3.3.1 Aspergillus tamarii FS132部分脂肪酶基因的获得

3.3.2 Aspergillus tamarii FS132脂肪酶基因组DNA(ATL-DNA)的获得

3.3.3阳性克隆子的筛选与验证

3.3.5 Aspergillus tamarii FS132脂肪酶cDNA克隆及序列测定

3.4小结

第4章Aspergillus tamarii FS132脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1材料

4.2.2方法

4.3结果与讨论

4.3.1 pMD19-T/ATL-cDNA重组质粒、pBluescript ks(+)质粒的酶切

4.3.2 PKS/ATL-cDNA重组质粒、pPIC 3.5K表达质粒的酶切

4.3.3重组质粒电转化至感受态毕赤酵母细胞

4.3.4重组酵母菌的平板筛选验证及PCR验证

4.3.5重组酵母的诱导表达及表达蛋白活性检测

4.4小结

第5章Aspergillus tamarii FS132产酶条件的初步优化

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果与讨论

5.2.1培养基初始pH对FS132产酶的影响

5.2.2空气量和培养温度试验

5.2.3发酵周期试验

5.3小结

结论

展望

附录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历