米曲霉FZ58β-葡萄糖苷酶固体发酵优化及酶学特性的研究

摘要

对米曲霉(Aspergillus oryzae)FZ58B-葡萄糖苷酶固体发酵进行优化。通过单因素试验确定最适碳源为甘蔗渣，最适氮源为黄豆饼粉，发酵初始pH为6.5，固液比为1/3，初步确定固体发酵的培养基配方。通过Plackett-Burman试验设计，考察影响米曲霉固体发酵8个因素对产酶的影响，筛选到对产酶结果影响最显著的3个因素，即麸皮，水和FeSO4。通过Box-Behnken设计的响应面分析法对所筛选到的3个显著因素进行优化，并获得最佳水平。优化后最适的发酵培养基配方(g/L)：MgSO40.5，K2HPO41，FeSO40.01，NaNO32，pH6.5，固形物m(麸皮):m(甘蔗渣):m(黄豆饼粉)=4:1.5:0.2，固液比为57:100。发酵条件优化结果：接种量为每5g固形物接种1mL的孢子悬液(浓度为5～7×106个/mL)，发酵温度33℃，发酵时间5天。经优化，产酶水平从最初的1002.6U/g达到1401U/g，比优化前提高了39.7％，优化效果较显著。 采用硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析与Sephacryl S-200分子筛柱层析等纯化步骤对该酶进行了纯化，纯化后酶的比活力为4125.72U/mg、纯化倍数为7.68、回收率为1.81％。SDS-PAGE电泳测定该蛋白分子量的大小为120.23kDa。 酶学特性研究表明：最适酶促反应温度为60℃，60℃以内酶促反应是相对稳定的；酶促反应最适pH为5.0；酶促反应在pH3～9稳定。以水杨苷、pNPG为底物分别进行酶的动力学研究，结果表明，两者的酶促反应都符合米氏方程，最大反应初速度Vm分别为0.21mg/mL/min，2500μmol/L/min，米氏常数Km分别为0.81mg/mL、1mmol/L，活化能(Ea)分别为60.80 kJ/mol、43.54kJ/mol。 金属离子对酶活力影响研究结果表明：在终浓度为0-2.5mmol/L时，K+、Li2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+离子对酶促反应无影响，Hg2+对酶促反应起抑制作用，其抑制作用属于可逆过程，其抑制机理表现为混合型抑制(既影响酶的米氏常数Km值，又影响最大反应速度Vm值)。 有机溶剂对酶活性影响的研究结果表明：甲醇、乙醇、1.2-丙二醇、异丙醇等几种有机溶剂对于酶促反应的影响都是所测酶活随着反应体系中有机溶液浓度的增加而降低，它们的IC50(酶活力下降50％的抑制浓度)分别是11％、10％、11.3％、12.8％。

目录

声明

摘要

第1章绪论

1.1前言

1.2纤维素酶系的组成及降解机理

1.3 β-葡萄糖苷酶的研究进展

1.3.1 β-葡萄糖苷酶的发现和研究概况

1.3.2 β-葡萄糖苷酶的生物学功能

1.3.3 β-葡萄糖苷酶的测定方法

1.3.4 β-葡萄糖苷酶的来源

1.3.5 β-葡萄糖苷酶的生产方法

1.3.6 β-葡萄糖苷酶的分离纯化

1.3.7 β-葡萄糖苷酶的酶学特性

1.3.8 β-葡萄糖苷酶的应用

1.4米曲霉概述

1.4.1米曲霉的菌落形态特征及分布

1.4.2米曲霉所产生的酶系及应用

1.4.3米曲霉产β-葡萄糖苷酶的研究

1.5 β-葡萄糖苷酶的研究趋势及背景展望

1.6试验设计优化

1.6.1 Plackett-Burman试验设计

1.6.2响应面分析方法在发酵优化中的应用

1.7选题依据及本项研究的主要内容

1.8研究的内容

第2章材料与方法

2.1试验材料

2.1.1菌种

2.1.2主要药品与试剂

2.1.3培养基

2.1.4主要仪器

2.2试验方法

2.2.1酶活测定方法

2.2.2发酵培养基优化

2.2.3发酵条件优化

2.2.4酶的分离纯化

2.2.5酶学性质的研究

2.2.6金属离子对酶促反应的影响

2.2.7有机溶剂对酶促反应的影响

第3章结果与讨论

3.1发酵培养基优化

3.1.1单因素优化

3.1.2 Plackett-Burman优化

3.1.3响应面试验设计与结果

3.2发酵条件优化

3.2.1接种量对产酶的影响

3.2.2发酵温度对产酶的影响

3.2.3发酵时间对产酶的影响

3.3酶的分离纯化

3.3.1硫酸铵分级沉淀

3.3.2 G-25脱盐

3.3.3离子交换层析

3.3.4分子筛层析

3.3.5 SDS-PAGE电泳测定酶蛋白分子量

3.4酶学性质研究

3.4.1酶的最适反应温度

3.4.2酶的温度稳定性

3.4.3酶的最适反应pH

3.4.4酶的pH稳定性

3.4.5酶的动力学研究

3.4.6酶促反应的活化能

3.5金属离子对酶促反应的影响

3.5.1不同浓度的KCl对酶活测定的影响

3.5.2不同浓度的Li2SO4对酶活测定的影响

3.5.3不同浓度的MgSO4对酶活测定的影响

3.5.4不同浓度的MnCl2对酶活测定的影响

3.5.5不同浓度的ZnSO4对酶活测定的影响

3.5.6 HgCl2对酶活测定的影响

3.6有机溶剂对酶促反应的影响

3.6.1乙醇对酶活测定的影响

3.6.2甲醇对酶活测定的影响

3.6.3异丙醇对酶活测定的影响

3.6.4 1，2-丙二醇对酶活测定的影响

3.7讨论

3.7.1发酵培养基的优化

3.7.2酶的分离纯化

3.7.3酶的酶学特性的研究

第四章结论与展望

4.1结论

4.1.1米曲霉β-葡萄糖苷酶固体发酵优化

4.1.2酶的分离纯化和酶学性质的研究

4.2研究展望

参考文献

攻读学位期间主要科研成果

致谢

个人简历