马铃薯卷叶病毒的分子鉴定与检测技术

摘要

马铃薯卷叶病毒是马铃薯上最重要的病毒病之一，严重地威胁着马铃薯的生产。根据已有的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(PLRVCP)基因序列(627bp)设计合成了一对特异性引物，用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法和酶联免疫吸附反应（ELISA)的方法检测到了马铃薯卷叶病毒。以带毒植物总RNA为模板，通过反转录-聚合酶链式反应扩增得到长0.62kb的目的片段，通过克隆载体pGEM-T将目的片段转入大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株上，构建了PLRVCP基因的克隆载体，并进行了测序。已经将测序所得到的序列登陆了NCBI。将序列测定结果与其他PLRV分离物CP基因序列进行比较，证明成功地得到了PLRVCP基因。对PLRVCP氨基酸序列与其不同分离物间进行的分子差异分析表明，PLRV不同分离物间CP氨基酸序列差异不太明显。依据PLRVCP氨基酸序列同源性建立了PLRV系统进化树并对PLRV不同分离物进行了类型分析。　　双酶切克隆载体的重组质粒pRCP并回收目的片段，将所得目的片段连接到表达载体PGEX-2T上。通过热激法将该表达载体转化入大肠杆菌。构建了PLRVCP基因的表达载体，摸索了一些PLRVCP基因的不能够表达的条件。　　利用合成的PLRV病毒特异性引物建立了PLRV的常规RT-PCR检测技术和核酸斑点杂交技术(Nucleicacidspothybridization，NASH)，并以NASH为重点，改进了NASH的检测技术。与原来的检测方法相比，改进后的方法更为实用：不但大大地缩短了检测所需要的时间，而且改进后检测方法的灵敏度也与常规方法的灵敏度基本相同。　　依据对上述病毒检测技术的研究结果，设计组装了马铃薯病毒的一步RT-PCR检测试剂盒和核酸斑点杂交检测试剂盒，实际应用结果表明：这些试剂盒具有稳定性强、灵敏度高、特异性好的优点。

目录

1前言

1.1马铃薯的经济价值及其种植

1.2马铃薯病毒与马铃薯病毒性病害

1.3马铃薯主要病毒及其危害简介

1.3.1马铃薯Y病毒

1.3.2马铃薯卷叶病毒

1.3.3马铃薯X病毒

1.3.4马铃薯S病毒

1.3.5马铃薯M病毒

1.3.6马铃薯A病毒

1.3.7马铃薯Y病毒坏死株系块茎坏死种

1.3.8烟草脆裂病毒

1.3.9马铃薯帚顶病毒

1.3.10马铃薯纺锤块茎类病毒

1.4马铃薯病毒的检测方法及其原理

1.4.1生物学实验方法

1.4.2电镜技术方法

1.4.3以抗体为基础的免疫学检测方法

1.4.4马铃薯病毒核酸分子检测技术

1.5血清学方法与分子生物学技术方法的比较

1.5.1对检测样品的要求

1.5.2敏感性和特异性

1.5.3病毒定量检测

1.5.4病毒基因分型

1.5.5检测的可操作性

1.5.6检测成本

1.6讨论与预测

2材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株

2.1.2质粒

2.1.3引物

2.1.4供试病毒

2.1.5试剂及酶类

2.2方法

2.2.1样品的采集

2.2.2样品的检测

2.2.3植物总RNA提取

2.2.4马铃薯卷叶病毒CP基因克隆载体和表达载体的构建

2.2.5融合蛋白的诱导表达及检测

2.2.6马铃薯病毒分子生物学检测方法的建立

2.2.7分子生物学检测方法的应用

3结果与分析

3.1样品的检测

3.1.1血清学检测

3.1.2反转录-聚合酶链式反应(PCR)法检测

3.2马铃薯卷叶病毒CP基因克隆载体的构建

3.2.1 RT-PCR扩增后纯化回收目的片段

3.2.2克隆菌的酶切鉴定1％琼脂糖凝胶电泳检测

3.2.3重组克隆菌的PCR鉴定

3.2.4克隆菌的DNA序列测定

3.2.5 PLRV CP基因序列测定及同源性比较

3.2.6 PLRV不同分离物CP氨基酸序列差异性分析

3.3马铃薯卷叶病毒CP基因克隆载体的构建

3.3.1重组克隆菌中目的片断的酶切鉴定

3.3.2重组克隆中目的片段的PCR鉴定

3.3.3表达载体中目的片段的DNA序列测定

3.4融合蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

3.5马铃薯病毒分子生物学检测方法的建立

3.5.1 RT-PCR检测技术的建立

3.5.2核酸斑点杂交检测方法的建立

3.6分子生物学检测方法的应用

3.6.1对河南怀山药的检测

3.6.2对龙岩山药组织培养苗的检测

3.6.3马铃薯病毒RT-PCR检测试剂盒的研制

3.6.4马铃薯病毒核酸斑点杂交检测试剂盒的研制

4讨论

4.1马铃薯卷叶病毒衣壳蛋白的表达

4.2 RT-PCR方法与核酸斑点杂交方法灵敏度的比较

4.3核酸斑点杂交方法改进前后检测灵敏度的比较

4.4核酸斑点杂交方法检测不同核酸的检测灵敏度的比较

5小结

5.1 PLRV CP基因序列的测定

5.2检测技术的建立

5.3核酸斑点杂交方法的改进

5.4 PLRV CP基因在大肠杆菌中表达条件的摸索

参考文献

致谢

附录1常见马铃薯病毒病在田间的症状表现及部分病毒粒子的形状

附录2缩写词和英汉对照

附录3本研究使用的主要试剂与溶液的配制

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