耐热木聚糖酶的体外分子进化及其生物信息学分析

摘要

木聚糖酶(E.C3.2.1.8)是一类以内切方式降解木聚糖分子中β-1，4-木糖苷键的酶系。它对自然界中大量存在的半纤维素起着重要的作用，该酶广泛应用于造纸、食品、饲料添加等方面。其中耐热木聚糖酶由于其耐热性好，被广泛运用于工业生产特别是造纸工业，因此已受到广泛的关注。 本研究以高产木聚糖酶的黑曲霉C3486(Aspergillus niger C3486)的基因组为模板，通过PCR扩增出木聚糖酶的特异性条带，连接到原核表达载体pET32a(+)，转化E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达后得到目的蛋白，纯化后所得蛋白Xyn-1不具有木聚糖酶活性。而后将木聚糖酶基因连接到真核表达载体pPIC9K，转化至毕赤酵母Pichia pastoris GS115中，纯化所得的木聚糖酶Xyn-2具有一定的酶活性。 然后再以Aspergillus niger C3486总RNA为摸板，进行RT-PCR后，重新转化至大肠杆菌中，所得的木聚糖酶Xyn-3也具有一定的酶活性。通过木聚糖酶DNA与cDNA的序列比对，发现该酶的的基因组中且一个大小约为50 bp的内含子。 通过生物信息学分析表明，该酶含有187个氨基酸，具有信号肽。并且具有典型的木聚糖酶保守区域，利用在线预测该酶进行三级结的预测，结果表明该酶是一个以β-折叠为主为的蛋白酶，形成一个紧密的球状蛋白。 通过Error PCR和DNA Shuffling体外分子进化技术，将来自于黑曲霉与里氏木霉的木聚糖酶基因进行共同进化，获得了耐热性进一步提高的木聚糖酶。

目录

文摘

英文文摘

声明

1文献综述

1.1木聚糖酶的分类

1.2木聚糖酶的特性

1.2.1木聚糖酶的诱导性

1.2.2木聚糖酶的耐热性

1.2.3木聚糖酶的耐酸碱性

1.3耐热木聚糖酶

1.3.1耐热木聚糖酶的来源

1.3.2耐热木聚糖酶的结构域

1.3.3耐热木聚糖酶的耐热分子机理

1.3.4耐热木聚糖酶的生产

1.3.5耐热木聚糖酶的体外分子进化

1.3.6耐热木聚糖酶的应用

1.4本研究的目的意义

2、木聚糖酶基因的克隆及生物信息学分析

2.1材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2试剂与仪器

2.1.3培养基

2.2实验方法

2.2.1木聚糖酶DNA的原核表达

2.2.2木聚糖酶DNA的真核表达

2.2.3木聚糖酶内含子的确定

2.2.4木聚糖酶的生物信息学分析

2.3实验结果与分析

2.3.1黑曲霉A.nigerC3486基因组的分离

2.3.2原核表达载体的构建

2.3.3真核表达载体的构建

2.3.4木聚糖酶内含子的确定

2.3.5木聚糖酶的生物信息学分析

2.4讨论

2.4.1融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

2.4.2融合蛋白Xyn-1的酶活测定

2.4.3木聚糖酶的真核表达

2.4.4XynD与XynC的序列差异

3、木聚糖酶基因的体外分子进化

3.1材料

3.1.1菌株与质粒

3.1.2培养基及试剂

3.2实验方法

3.2.1目的基因的PCR扩增

3.2.2以Error prone PCR获得突变基因文库

3.2.3 DNA shuffling

3.2.4突变文库的构建和筛选

3.2.5木聚糖酶及其突变体的蛋白诱导及检测

3.2.6木聚糖酶耐热突变体的耐热性研究

3.2.7木糖标准曲线

3.2.8蛋白质含量的测定

3.2.9木聚糖酶的酶活性及酶动力学常数测定

3.3实验结果与分析

3.3.1突变载体的构建

3.3.2目的片段的PCR扩增

3.3.3 Error prone PCR获得突变基因文库

3.3.4A DNA shuffling

3.3.5突变文库的构建和筛选

3.3.6木聚糖酶耐热突变体的诱导表达

3.3.7木聚糖酶耐热突变体的酶活测定

3.3.8木聚糖酶耐热突变体的耐热性研究

3.3.9木糖标准曲线的制作

3.3.10蛋白标准曲线的制作

3.3.11木聚糖酶及其耐热突变体的酶活性及Km、Kcat、Vmax的比较

3.4讨论

3.4.1木聚糖酶的体外分子进化

3.4.2木聚糖酶突变体酶的筛选

3.4.3木聚糖酶XynT、XynA及其突体的酶活性及相关参数的比较

3.4.4木聚糖酶突变体XynJ2

4、总结与展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

附录：溶液及试剂

致谢