一种耐热耐碱木聚糖酶酵母工程菌及其耐热木聚糖酶的生产方法

摘要

本发明提出一种提高木聚糖酶热稳定性的方法和一种产耐热耐碱重组木聚糖酶的酵母基因工程菌HB148n3。是通过将来自短小芽孢杆菌的木聚糖酶XYNHB第214位的天冬酰胺突变成丙氨酸，通过在毕赤酵母表达的糖基化修饰，而使重组木聚糖酶热稳定性提高，具体表现为在60℃的半衰期由12分钟提高到65分钟，其它性质不变。将该突变的基因插入到毕赤酵母整合表达载体中，导入到毕赤酵母菌中，从中筛选出一种高效表达耐热耐碱小分子量木聚糖酶的酵母基因工程菌，用该酵母基因工程菌发酵的重组木聚糖酶，发酵粗酶酶活性可达650U/ml。

说明书

技术领域

本发明涉及的是木聚糖酶酵母工程菌及其木聚糖酶的生产方法，特别是一种耐热耐碱木聚糖酶酵母工程菌及其耐热木聚糖酶的生产方法，是对木聚糖酶的改进。

背景技术

木聚糖酶在造纸制浆、食品、纺织、饲料、能源工业中具有广阔的应用前景。在造纸工业，利用木聚糖酶作为纸浆漂白助剂不仅可以提高纸张的白度和强度，而且可以减少氯的用量，从而降低生产成本，减轻对环境的污染；另外，采用木聚糖酶脱除废纸中的油墨，可以提高纸张白度，克服化学方法造成的环境污染。在饲料行业，添加到饲料中的木聚糖酶通过水解木聚糖可缓解木聚糖在饲料中的抗营养作用，促进动物对营养的吸收。在食品工业，应用木聚糖酶加工面包食品，可以水解面粉中的木聚糖产生木寡糖，从而改善面包的质地、结构和松软度。另外，木聚糖酶还可应用于酿造行业，甚至有报道木聚糖酶可以用来生产生物燃料，缓解能源紧张的问题。

但是，木聚糖酶要实现有效应用，要求木聚糖酶具有良好的酶学性质，在不同领域的应用要求木聚糖酶具有不同酶学性质。如应用于造纸行业，则要求该酶能在碱性条件及较高温度下具有高的木聚糖酶活性，而不具有纤维素酶活性。

如国外报道的从短小芽孢杆菌克隆到一个11家族的木聚糖酶基因xynHB(GeneBank收录号：AY954630)，在毕赤酵母表达后，表达酶活性为642U/ml，测得表达酶在60℃的半衰期是12分钟，在pH 6-9，40-60℃之间维持80％的酶活(Biocatalysis and biotransformation，2006，24(5))。

发明内容

本发明的目的是使用基因突变的方法提高木聚糖酶基因xynHB编码产物的热稳定性，通过定点诱变，获得突变基因，该突变的重组木聚糖酶基因在毕赤酵母表达后热稳定性提高，通过基因工程的手段构建能高效表达重组木聚糖酶的酵母基因工程菌，并从中培养分离纯化制取耐热耐碱的重组木聚糖酶，从而能高效、经济地用于纸浆漂白、生产低聚木糖等。

本发明是这样实现的，以已知序列的11家族木聚糖酶出发，将N端催化活性中心谷氨酸(Glu)附近糖基化位点的氨基酸N突变成不能糖基化的氨基酸，通过在酵母细胞表达，生产出热稳定性高的木聚糖酶。

具体做法是，设计合成一对引物P8n3-1和P8n3-2，通过DpnI介导的定点诱变方法，将来自短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因xynHB(GeneBank收录号：AY954630)第639和640位核苷酸AA突变成GC，使得214位氨基酸N突变成A，通过测序证实突变DNA片段的正确。从而获得突变的重组木聚糖酶基因xynHBn3。设计合成一对引物P81和P82，应用常规PCR方法用突变的DNA为模板，在常规的PCR扩增条件下(具体条件为：94℃，5min；94℃，30sec，58℃，30sec，72℃，1min；72℃，7min)，扩增出0.7kb的DNA片段，并将此上述的突变基因插入到毕赤酵母整合表达载体pHBM905A中，然后将得到的含耐热耐碱重组木聚糖酶基因的表达载体导入到毕赤酵母GS115中，再从中筛选出一株高效表达耐热耐碱重组木聚糖酶的酵母基因工程菌菌株HB148n3。

该菌株于2006年8月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M206076，名称为毕赤酵母HB148n3(Pichia pastoris HB148n3)(以下简称HB148n3)。

HB148n3菌株的菌学特性：

a、形态特性：毕赤酵母菌的无性生殖为芽殖，有时有假菌丝。有性生殖产生子囊内含有1-4枚光滑圆形、礼帽形或土星子囊孢子。

b、生理生化特性：毕赤酵母菌能利用特殊的物质为原料生长，如石油、甲醇、氨态氮、有机酸等。HB148n3菌株具有毕赤酵母菌的生理生化特性，同时因插入了突变的重组木聚糖酶基因，具有高效表达耐热耐碱重组木聚糖酶的特性。

将工程菌HB148n3在以甘油为碳源的培养基中，20-30℃培养至细胞密度OD600达到20时，加入甲醇在20-30℃，经24-72小时诱导培养(每隔24小时测酶活，酶活性达650U/ml时停止诱导培养)，将完成培养的酵母基因工程菌经离心除去菌体，收集上清液，经过30-75％饱和度的硫酸铵沉淀浓缩即得重组木聚糖酶产品。

表达的重组酶的热稳定性显著提高，经测试热稳定性60℃的半衰期由12分钟提高到65分钟。摇瓶发酵表明该酶在酵母的表达量高达650U/ml。该酶分子量小于30kDa，在40-60℃之间维持80％的酶活，最适pH在6-9，粗酶液不含纤维素酶活性，特别适于作为纸浆预漂白助剂。

上述的重组木聚糖酶粗酶液热稳定性的测量方法，其步骤为：

1)用0.05M的磷酸盐缓冲液配制1％浓度的桦木木聚糖溶液；

2)将粗酶液在60℃放置，间隔一定时间取样，在50℃测定相对酶活，计算半衰期为65分钟。

本发明的木聚糖酶生产成本低，具有更佳的耐热耐碱性能，且不具任何纤维素酶活性，更适合我国造纸漂白工艺，具有更高的市场价值。具体体现如下：1)酶活高。2)酶学性质好。在60℃的半衰期达65分钟，另有很宽的pH值范围，适于不同的造纸工艺。3)后处理简单。其它来源的木聚糖酶后处理精制成本高，相应的价格要高，利用酵母基因工程菌HB 148n3生产的粗酶液可直接用载体吸附干燥后就可以达到商品的要求，生产成本相对低。4)工程菌HB148n3生产的酶不具有纤维素酶活性，而细菌来源的产品大多具有纤维素酶活性，如果纯化不彻底，会降低纸张的硬度，降低产品质量。5)本产品为小分子量11家族的木聚糖酶，更易于渗入纸浆或其它底物。

具体实施方式

实施例1：通过DpnI介导的定点诱变方法，设计诱变引物P8n3-1和P8n3-2，以质粒pHBM130(基因xynHB连在pMD18T载体上)为模板进行PCR反应，将基因xynHB第639和640位核苷酸AA突变成GC，使得基因产物第214位氨基酸N突变成A，经测序证实突变DNA片段的正确。诱变PCR产物转化大肠杆菌，挑取重组子以引物M13进行测序验证，第639和640位核苷酸AA突变成GC的为正确突变子。将此突变基因插入到毕赤酵母整合表达载体pHBM905A中，然后将得到的含突变木聚糖酶基因的表达载体导入到毕赤酵母GS115中，转化子点种在含交联木聚糖的底物平板上，再从中筛选出出现最大水解圈的一种高效表达耐热耐碱重组木聚糖酶的酵母基因工程菌HB148n3菌株。

实施例2：将实施例1得到的HB148n3菌株在以甘油为碳源的培养基中，20-30℃摇瓶培养，使细胞密度对应的OD600达到20，再转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中于20-30℃诱导培养。诱导培养72小时，每隔24小时取样，对所取样进行分析，当产酶水平达650U/ml以上时，停止诱导，离心分离菌体，收集含重组木聚糖酶的上清液，即为粗酶液，对粗酶液进行酶活测定，酶活性为650U/ml。经过30-75％饱和度的硫酸铵沉淀浓缩即得重组木聚糖酶产品。

用0.05M的磷酸盐缓冲液配制1％浓度的桦木木聚糖溶液，将上述粗酶液在60℃放置30分钟，其间间隔一定时间取样，在50℃测定相对酶活，测得该酶在60℃预处理30分钟，还有90％的残余酶活。以1％浓度的桦木木聚糖溶液为底物，测定突变酶的其它酶学性质，和突变前一致。

实施例3：将实施例1得到的HB148N3菌株，在以甘油为碳源的培养基中，20-30℃培养至细胞密度OD600达到20时，再转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中于20-30℃诱导培养。诱导培养36小时，每隔12小时取样，对所取样进行分析，当产酶水平达650U/ml以上时，停止诱导，离心分离菌体，收集含重组木聚糖酶的上清液，即为粗酶液，对粗酶液进行酶活测定，酶活性为650U/ml。经过30-75％饱和度的硫酸铵沉淀浓缩即得重组木聚糖酶产品。

用0.05M的磷酸盐缓冲液配制1％浓度的桦木木聚糖溶液，将上述粗酶液在60℃放置120分钟，其间间隔一定时间取样，在50℃测定相对酶活，测得半衰期为65分钟。以1％浓度的桦木木聚糖溶液为底物，测定突变酶的其它酶学性质，和突变前一致。