茶树菇多糖提取工艺与生物活性关系的研究

摘要

本研究以茶树菇为材料,设计单因素试验和正交试验,选取既能很好保持茶树菇多糖(Agrocybe cylindracea Polysaccharide简称ACP)生物活性又能提高茶树菇多糖得率的最佳提取工艺组合。采用不同的脱蛋白方法纯化茶树菇粗多糖,以确定最佳脱蛋白工艺。通过柱层析方法分离茶树菇多糖,对其分离组分进行分子量测定,得出活性好的多糖分子量分布的特点规律,应用于生产中,建立一套简便快速的茶树菇多糖类产品品质评价标准。为其它真菌多糖类产品品质评价体系的建立提供参考依据。
　　 1单因素提取条件对茶树菇多糖得率及活性的影响
　　 设计单因素试验,固定其它因素,改变一个因素的条件,通过多糖提取率的测定和多糖活性试验的鉴定,确定这一因素的最适条件,并为下一步正交试验的设计提供参考依据。选择的因素有:浸提温度,pH值,以及细胞破碎方式等几个因素。结果表明:通过对单因素提取工艺条件的讨论,选取pH为7.0、7.5、8.0作为正交试验pH的三水平。选取70℃、80℃、90℃作为正交试验温度的三水平。微波处理6 min,功率400 w:超声波处理30 min;冻融3次作为正交试验细胞破碎方式这一因素的三水平。
　　 2提取工艺对茶树菇多糖得率及活性的影响
　　 依据单因素预试验结论,按照L9(33)正交试验表进行设计,做三因素三水平正交试验,通过多糖提取率的测定和多糖活性试验的鉴定,确定最佳的提取工艺组合。结果显示:提高茶树菇多糖得率的最优工艺组合为:温度为90℃,pH值为7.5,细胞破碎方式是冻融3次;提高茶树菇多糖含量的最优工艺组合为:温度为80℃,pH值为7.5,细胞破碎方式为超声波处理30 min;增强茶树菇多糖体外抗脂质过氧化活性的最佳工艺组合为:温度为80℃,pH值为7.5,细胞破碎方式为冻融处理3次;促进小鼠巨噬细胞NO生成量的最佳工艺组合为:温度为80℃,pH值为7.5,细胞破碎方式为超声处理30 min。综合多因素分析考虑,高温及强碱不利于多糖生物活性的保持,冻融处理虽然能显著提高多糖得率,且能很好的保持多糖生物活性,但是违背了简化工艺,降低成本的原则,因此依据正交试验的结果,提取温度为80℃,pH值为7.5,细胞破碎方式为超声波30 min为最佳提取工艺组合。
　　 3不同脱蛋白工艺对茶树菇多糖活性的影响
　　 采用Sevag法、酶法与Sevag法联用、三氯乙酸法、三氯乙酸法与Sevag法联用、等电点法对茶树菇多糖进行脱蛋白研究。以多糖保存率和蛋白脱除率为指标,比较这五种方法的脱蛋白效果,并用脱过蛋白的初级纯多糖做活性试验,确定最佳的脱蛋白工艺。结果表明:用Sevag法、酶法与Sevag法联用、三氯乙酸法、三氯乙酸法与Sevag法联用、等电点法对茶树菇多糖进行脱蛋白研究。结果表明:就五种脱蛋白方法来说,Sevag法脱蛋白效果以及对多糖活性的保持都是最好的。单从多糖的抗脂质过氧化活性的保持方面来看,不脱蛋白的多糖活性更好。
　　 4多糖分子量与活性的关系
　　 将提取的茶树菇多糖分别通过葡聚糖凝胶柱和DEAE-52阴离子交换柱,将分离得到的多糖组分做高效分析,并且与葡聚糖标准品的高效图谱做比对分析,分别得出各个组分的分子量分布范围;对各组分做抗脂质过氧化试验,和体外促进巨噬细胞生成NO等活性试验,筛选出活性较好的组分,从而确定活性较好的茶树菇多糖的分子量分布范围。通过对多糖分子量分布范围与多糖生物活性分析比较可以发现,就茶树菇多糖抗脂质过氧化活性而言,分子量在数量级为105时,多糖的抗脂质过氧化活性较好,分子量过大或者过小,都影响其活性。
　　 对于茶树菇多糖刺激巨噬细胞生成NO的活性来说,ACP2-3活性最差,分子量范围是5.50×104-3.16×105,ACP2-4活性最好,分子量范围是7.59×105-4.90×106。ACP2-3是4种组分中分子量最小的一种,而ACP2-4较之其它组分,分子量相对较大,由此可以推出分子量大的茶树菇多糖刺激巨噬细胞生成NO的活性比分子量小的强,但多糖分子量与刺激巨噬细胞生成NO的活性是否成正相关,还需进一步研究。
　　 根据上述结果,可以看出,不同分子量的多糖,其生物活性有很大的差别,因此在工业加工过程中一定要注意多糖加工工艺的选择,根据多糖的用途,设计适当的加工工艺,以确保能更好的提取出有活性的多糖。