‘红肉蜜柚’与‘红绵蜜柚’汁胞差异蛋白质组学研究

摘要

果实色泽是决定果食商品性的重要因素之一，近年来，越来越多研究者着手对果实着色原因及色泽发生发展规律展开研究，旨在发现果实色泽的来源途径，以及呈色物质在果实发育过程中的代谢途径，以期为果实色泽发育理论奠定基础，并为果实着色调控和果实色泽育种提供理论依据。‘红肉蜜柚’和‘红绵蜜柚’均是基于琯溪蜜柚遗传基础上变异而来，二者具有极近的亲缘关系，却又有不同的呈色表现，这为研究柚类果实色泽发育提供了良好的材料。本研究以这两个柚类品种为实验材料，采用差异蛋白质组学研究方法，寻找柚果实汁胞转色过程中存在的差异蛋白，经过 MOLDI-TOF-TOF质谱鉴定和生物信息学分析，获得了若干可能影响柚果实汁胞呈色的相关蛋白。主要研究结果如下：
　　1、通过SDS-PAGE方法对比了TCA丙酮蛋白沉淀和酚抽提取两种蛋白质样品制备方法，发现酚抽提取法更适合于蜜柚汁胞转色时期的蛋白质提取。在进行蜜柚果实汁胞双向电泳时，在传统酚抽提取蛋白制备方法上进行了三点改进：①用丙酮对研磨后的样品进行浸洗，②对丙酮浸洗过的样品沉淀进行二次研磨，③在一次酚抽提取过后，分两次加入与酚等体积的酚抽提取液进行反复抽提。
　　2、对蜜柚果实汁胞蛋白质双向电泳体系进行了优化，采用18 cm，pH3-10 L和18 cm， pH4-7 L相结合的分析策略，能获得分辨率更高的双向电泳图谱。18 cm，pH3-10 L和18 cm，pH4-7 L第一向等电聚焦最佳参数分别是30000 vhs和43000vhs。
　　3、通过比对各时期两个蜜柚品种的汁胞双向电泳图谱，找出了差异蛋白点129个，红肉蜜柚相较于红绵蜜柚下调表达的蛋白质点总78个，红肉蜜柚相较于红绵蜜柚上调表达的蛋白质点41个。由于在果实发育的过程中，汁胞内的蛋白质组成成分不断发生着变化，进一步分析了红肉蜜柚与红绵蜜柚在果实发育过程中处于变化的蛋白点是否存在着不同的变化规律，最终找到了34个这种变化规律上存在差异的蛋白质点。
　　4、将获得的差异蛋白质点进行MOLDI-TOF-TOF质谱鉴定，通过生物信息学分析发现：红肉蜜柚和红绵蜜柚汁胞中类胡萝卜素合成途径上的特征酶不存在差异，在红绵蜜柚中也不存在可使类胡萝卜素降解的酶，故推测红绵蜜柚中的番茄红素很有可能是被转运到了汁胞之外。
　　5、红肉蜜柚相较于红绵蜜柚上调表达的蛋白质多数参与了呼吸代谢过程和抗氧化系统，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶、焦磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶等。红绵蜜柚相较于红肉蜜柚上调表达的蛋白质多数与应激反应相关，包括17个热激蛋白和5个LEA蛋白。两个品种果实有着两种不同的应激反应方式，红肉蜜柚汁胞是通过提高呼吸作用产生抗氧化物酶来清除活性氧，而红绵蜜柚汁胞则是通过提高细胞的耐受能力来解除伤害，也许正是由于这两种应激反应方式的不同影响了汁胞番茄红素的代谢和积累，从而发生颜色上的差异。
　　6、发现两个差异蛋白质在红肉蜜柚汁胞中上调表达显著，但具体功能未知。

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第一章 前言

1 果实色泽研究

2 柑橘果实呈色的相关研究

3蛋白质组学在作物科学研究中的应用

4 本研究的目的意义和内容

第二章 柚果实汁胞双向电泳体系建立

1 材料与试剂

2 试验方法

3 结果与分析

4 讨论与小结

第三章 红肉蜜柚与红绵蜜柚果实汁胞转色过程中的双向电泳分析

1 材料与方法

2结果与分析

3 讨论与小结

第四章 红肉蜜柚与红绵蜜柚果实汁胞转色过程中差异蛋白点的质谱鉴定和生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3讨论

第五章 总结与展望

参考文献

附录：部分蛋白点MOLDI-TOF-TOF质谱图示例

致谢