嗜热环糊精葡萄糖基转移酶的分子改造

摘要

环糊精（Cyclodextrin, CD)因有独特的内疏水外亲水结构，能改变其它分子的物理化学性质，广泛应用于化妆品、食品、医药等诸多领域。酶法合成是工业化生产环糊精的主要方法，即利用环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin glycosyltransferase, CGTase）的环化反应将淀粉或相关基质合成环糊精。本论文以来源于地芽胞杆菌CHB1环糊精葡萄糖基转移酶为研究对象，通过分子生物学方法对其进行改造，提高其利用可溶性淀粉等底物生成环糊精的转化率、可溶性表达、产物特异性。主要研究工作如下：
　　（1）通过易错PCR技术向CGTase基因cgt中引入随机突变，建立突变文库，利用96孔板筛选系统得到胞外酶活和可溶性表达提高的突变体ds-6和ep-9，其胞外α-环化活力分别是原始酶的1.72倍和2.18倍，可溶性表达量提高了1倍。序列分析表明，突变体ep-9有三个碱基发生了变化：g2005a/a2037g/t2081g，有两个氨基酸发生改变。酶学性质表明：突变体ep-9的β-环化比活力是原始酶的2.44倍，总环化比活力提高了34％，Km值由4.3 g/L降低到3.74 g/L；在pH稳定性方面较原始酶有所提高。单碱基定点突变证实突变体ep-9可溶性表达水平及胞外酶活性提高的关键突变是g2005a。研究结果表明g2005a突变对于提高CGTase的可溶性表达及胞外酶活起关键作用，这对认识CGTase的构效关系以及进一步改造该酶分子、扩大酶的生产应用具有重要意义。
　　（2）为了研究来源于地芽胞杆菌CHB1的环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）的催化效率和产物特异性的作用机理，对其氨基酸序列和模拟结构进行了分析，确定其淀粉结合位点2处第623位氨基酸残基可能影响其催化效率。运用重叠PCR技术，在其淀粉结合位点2处第623位进行定点饱和突变，构建19种不同氨基酸残基突变体。将突变基因与pET-28a(+)-ompA载体连接并在大肠杆菌BL21(DE3）中表达。以可溶性淀粉为底物，HPLC分析反应产物中的环糊精含量变化。结果表明，相对于野生型CGTase，突变酶N623T的催化效率明显提高，总环化活力提高了58.6%，α-环化活力提高了64%，β-环化活力提高了80.5%，而γ-环化活力降低了35.3%。产物特异性方面，相比野生型CGTase，突变酶N623T的淀粉总转化率从11.3%提高至39.7%，提高了251.3%，其中α-环糊精、γ-环糊精所占比例缩减为32.8%和7.7%，β-环糊精提高至59.5%。分析其可能机理为：与野生型CGTase相比，突变体N623T中苏氨基酸残基代替了天冬酰胺，造成淀粉结合位点2处的构象发生了变化，该构象优化了底物作用方向，有利于反应的进行，从而提高了酶的催化效率。
　　（3）以融合酶与底物麦芽六糖的结合自由能为指导从CBM20家族中选出一种CBM，利用重叠PCR技术构建了融合酶CGT△E-CBMbc251基因并将其插入pET-28a(+)-OmpA载体中实现异源表达。以可溶性淀粉为底物时，融合酶的三种环化活力有不同程度的提高，α-，β-，γ-环化活力分别40.2%、24.3%和181.58%。对酶学性质分析，结果表明两种酶的最适反应温度都是60℃，融合酶的最适反应pH比原始酶增加了1，为pH6.0。以可溶性淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉为底物测两种酶的反应动力学性质，结果表明融合酶的米氏常数Km都有所降低，对底物的亲和力增加了，催化效率Kcat/Km分别提高了1.31、0.17和3.72倍。通过对融合酶和原始酶CGT△E-CBMbc251模拟结构与底物麦芽六糖的分子对接分析，结果表明与原始酶相比，融合酶与底物的分子对接自由能明显比较低，说明融合酶与底物结合能力比原始酶要强，反应更易进行。三维结构图显示，两者的区别在于淀粉结合结构域的构象发生了变化。
　　（4）通过优化表达条件，提高环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的可溶性表达和胞外酶活性。本研究构建了含 cgt基因的重组表达质粒pET-28a(+)-ompA-cgt，筛选最适诱导温度，并构建5种分子伴侣共表达系统(pKJE8、pKJE7、pGro7、pTf16和pG-Tf2，5种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pET-28a(+)-ompA-cgt共表达)，筛选最适分子伴侣质粒，优化共表达条件。结果表明通过SDS-PAGE分析和测定胞外酶活，CGTase在大肠杆菌中成功实现表达，且具有一定量的重组CGTase分泌至胞外；25 ℃诱导时CGTase的可溶性表达和在胞外上清中的酶活都最高；分子伴侣质粒pKJE8使酶的胞外活性提高了48.6%，效果最为显著；当L-阿拉伯糖浓度为0.5 g/L时，分子伴侣质粒pKJE8使酶的胞外活性提高了68.5%。
　　研究表明通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了CGTase的可溶性表达和胞外酶活，为该酶进一步相关研究奠定了基础。