大黄鱼蛋白源抗氧化肽的制备、性质及抗氧化机理研究

摘要

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)属鲈形目，石首鱼科，蛋白质含量丰富，是我国特有的地方性鱼类。闽东地区是我国大黄鱼优势养殖区域。然而，我省大黄鱼大部分以鲜销品或冷冻销售为主，精深加工技术落后，产品附加值低。随着养殖规模扩大和养殖技术的提高，也产生了产品供过于求等问题。制备大黄鱼抗氧化肽是推动大黄鱼精深加工的重要途径。本论文以大黄鱼为原料，采用超声波辅助可控酶法水解技术制备抗氧化肽。通过超滤分离技术对抗氧化肽进行分级分离，借助体外抗氧化试验对各分离组分的抗氧化活性进行研究并筛选具有最强抗氧化功能的组分。进而借助动物实验对该组分的抗氧化能力进行评价并采用代谢组学的研究策略，从代谢水平阐明其作用机理。同时，研究了该组分的基本理化特性和抗氧化稳定性。在此基础上，进一步采用离子层析、凝胶层析、反相高效液相色谱及质谱测序技术对该组分进行分离、纯化和鉴定。本论文旨在为大黄鱼的深度开发和应用，提高大黄鱼资源的附加值提供理论依据和技术基础。
　　首先分析了大黄鱼的基本组成，以蛋白质的氨基酸组成评价其营养价值。大黄鱼鱼肉水分含量69.1％，粗蛋白含量为17.5%，粗脂肪含量11.1%，灰分含量为1.1%。其氨基酸组成合理，必需氨基酸总量所占比例为40.84%，除缬氨酸外，必需氨基酸含量都超过理想蛋白质模式；具有给质子能力的氨基酸占40.96%，其中芳香族氨基酸9.49%，疏水氨基酸占36.79%，是一种优质的制备抗氧化肽的蛋白质资源。
　　选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和复合蛋白酶水解大黄鱼蛋白，以蛋白水解度、水解液O2-·清除力和还原力为评价指标，筛选出中性蛋白酶为最佳水解用酶。通过单因素试验和响应面试验设计，获得中性蛋白酶水解大黄鱼蛋白制备抗氧化肽的最优工艺条件：水解温度46℃、底物浓度26.55%、水解时间7.2 h、水解pH7.0和酶添加量2400U·g-1，在该条件下，所得水解液水解度为36.51%、O2-·清除率87.46%和还原力0.963，抗氧化肽的得率为34.8%。超声波预处理可显著提高大黄鱼蛋白水解物抗氧化能力，经单因素试验和响应面优化得到最优超声波预处理条件为：超声波功率700W、超声波时间24 min和超声波温度59.3℃。此时，抗氧化肽的得率也提高至40.1%。
　　依次采用截留分子量为10 kDa、5 kDa、3 kDa超滤膜对大黄鱼蛋白源抗氧化肽进行分级分离，获得四个不同分子量范围肽组分LYCP-I(>10 kDa)、LYCP-II(5~10 kDa)、LYCP-III(3~5 kDa)和LYCP-IV(<3 kDa)。借助几种体外化学抗氧化试验比较不同超滤组分抗氧化活性，结果表明：LYCP-IV表现出最强的体外抗氧化活性，其O2-·清除力、DPPH·清除力和Cu2+螯合力的IC50值分别为7.610、7.681、7.842 mg/mL，并且当其浓度达到15 mg/mL时，还原力为0.721。进一步研究LYCP-IV对HepG2细胞毒性及细胞抗氧化活性影响，结果表明LYCP-IV预处理对HepG2细胞无明显毒副作用，LYCP-IV预处理可显著降低H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤，提高HepG2细胞存活率，同时细胞内抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性以及GSH水平显著提高。
　　采用D-半乳糖诱导衰老小鼠模型研究LYCP-IV对氧化应激的抑制作用。结果表明低、中、高剂量LYCP-IV和拮抗组能改善模型组小鼠冷漠、嗜睡、反应迟钝、脱毛和食欲不振现象，显著降低小鼠肝脏指数，且高剂量组和拮抗组小鼠肝脏指数与正常组无显著差异(p>0.05)。模型组小鼠体重增长显著减少(p<0.01)，低、中、高剂量组、VE组和拮抗组小鼠体重均显著增加，其中拮抗组体重增加最大。LYCP-IV可降低D-半乳糖诱导衰老小鼠MDA含量，增强抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px、GR活性，提高GSH含量，同时可降低血清中ALT和AST活性，具有很好的体内抗氧化作用。
　　采用CCl4建立氧化损伤大鼠模型，从代谢组学角度研究LYCP-IV对氧化应激损伤的抑制作用。结果表明，与正常组相比，氧化应激导致大鼠糖酵解、氨基酸分解代谢、色氨酸循环、三羧酸循环和花生四烯酸代谢紊乱，其中模型组丙酮酸盐、乙酰乙酸、蛋氨酸、半胱氨酸、16(R)-HETE和花生四烯酸含量显著下降，而苏氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、琥珀酸、延胡索酸和亚麻酸显著升高。LYCP-IV处理可使丙酮酸盐、乙酰乙酸、苏氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、琥珀酸、延胡索酸、亚麻酸、16(R)-HETE和花生四烯酸含量发生相反变化，缓解紊乱程度，提示LYCP-IV可调节和改善CCl4氧化损伤所致大鼠氨基酸代谢以及与氨基酸有关的脂肪和糖代谢，一定程度改善氧化应激大鼠的代谢状态。
　　研究不同条件和不同浓度下LYCP-IV的理化和功能功能性质，包括溶解性、吸水性、持水性、吸油性、表观粘度、起泡性和乳化性。研究表明，在pH3-10范围内，LYCP-IV的相对溶解度大于80%，溶解性好。在温度为40℃时，LYCP-IV吸油性最强，超过70℃后吸油性显著降低。LYCP-IV具有较好的吸水性，但持水性较差。此外，LYCP-IV溶液粘度较低，流动性好。pH4为肽的等电点，此时LYCP-IV的相对溶解度最低。在等电点附近LYCP-IV的乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性达到最高，但随着pH值偏离等电点而呈不同程度下降。乳化性则随pH值上升呈先下降后上升的趋势，当pH4时乳化性最低。另外，随着LYCP-IV浓度的增加其乳化性、起泡性和泡沫稳定性都有一定程度的提高，而乳化稳定性则表现出下降的趋势。
　　研究NaCl、温度、pH值、紫外线辐射、糖、金属离子和模拟胃肠道消化对LYCP-IV抗氧化稳定性的影响。结果表明LYCP-IV与糖在30℃混合，或与少量NaCl、K+或Ca2+混合时表现出良好的抗氧化稳定性。温度低于80℃和短时间紫外线照射对抗氧化活性影响不显著。超过24 h的紫外线照射，或添加Fe2+、Fe3+、Zn2+导致肽的活性显著下降。在酸性和中性pH条件下，pH对LYCP-IV的DPPH·清除力影响不大，但当pH>8时，LYCP-IV的DPPH·清除力显著下降。Cu2+螯合力变化趋势与DPPH·清除力相反。肽与还原糖在70℃混合时，DPPH·清除力显著提高。此外，模拟胃道消化前30 min Cu2+螯合力和DPPH·清除力逐渐增加，进一步的胃道和肠道消化LYCP-IV抗氧化活性不断下降，LYCP-IV抗氧化活性变化与其疏水性变化趋势一致。
　　通过离子交换层析、凝胶层析和反相高效液相色谱分离技术，根据肽组分的带电性、分子量大小和疏水性的不同进一步对LYCP-IV进行分离纯化，对各级分离纯化所得肽组分抗氧化活性进行评价，最后通过ESI-MS/MS进行氨基酸序列鉴定，得到两个具有较强抗氧化活性的肽段，氨基酸序列结构为Ser-Arg-Cys-His-Val和Pro-Glu-His-Trp。经化学合成后，分别采用DPPH·清除力、O2-·清除力验证其抗氧化能力，结果表明两个肽段均具有较强的抗氧化能力。