脑内Oatp2与AEDs的相关性及其影响因素的实验研究

摘要

第一部分大鼠体内0atp2表达状况及其年龄特征 目的：探讨Oatp2在正常大鼠脑、肝组织内的表达及年龄因素对其表达的影响。 方法：健康成年，生后20天，生后3天的Wistar大鼠各12只，雌雄各半。取脑、肝组织，免疫组化检测Oatp2蛋白的分布及表达，RT-PCR检测Oatp2-mRNA表达，比较年龄因素对Oatp2表达的影响。 结果：(1)正常大鼠脑内Oatp2主要分布于脑微血管内皮细胞、脉络丛上皮细胞及小脑神经元；(2)正常大鼠肝内Oatp2主要表达于肝细胞，以门静脉周围最为显著；(3)脑内Oatp2表达呈现随年龄增加表达下降趋势，而肝内Oatp2表达则随年龄增加而增加。 结论：(1)正常大鼠脑、肝内均存在Oatp2表达，提示Oatp2在相应底物的体内过程中具有重要作用；(2)年龄是影响大鼠脑、肝内Oatp2表达的因素。 第二部分痫性发作和AEDs对脑内Oatp2表达的影响 目的：研究痫性发作及AEDs对大鼠脑内Oatp2表达的影响。 方法：健康成年Wistar大鼠，经腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱发60min持续’惊厥发作(60’SC)，(1)在60’SC后6h-8w的6个不同时点上，采用免疫组化法检测Oatp2在脑、肝内的分布，Western blot和RT-PCR检测Oatp2蛋白及mRNA的表达水平，研究各时点Oatp2表达的动态变化；(2)选取60’SC后4w大鼠，分别予VPA(187.5mg/kg)、CBZ(125mg/kg)、PHT(62.5mg/kg)治疗4周后，采用免疫组化法检测大鼠脑、肝组织内Oatp2、P-gp的分布，western-blot及RT-PCR方法分别检测Oatp2、P-gp蛋白质及mRNA的表达水平。 结果：(1)脑内P-gp主要分布于脑血管内皮细胞及脉络丛上皮细胞；(2)60’SC后各时点及AEDs治疗各组大鼠脑内Oatp2、P-gp仍主要表达于脑血管内皮细胞及脉络丛上皮细胞；(3)在60’SC后各时点的脑内Oatp2蛋白表达随时间延长而有下降趋势，以60’SC后8w最为显著(P<0.01)；(4)慢性癫痫(60’SC后4w、8w)大鼠脑内存在Oatp2表达下降及P-gp表达增加，且变化程度与SRSs次数呈正相关；(5)各治疗组脑内Oatp2蛋白表达较正常对照组明显下降(P<0.05)，而P-gp表达则较正常对照明显增加(P<0.05)；(6)各组脑内P-gp蛋白表达与mRNA表达具有较好的一致性，而脑内Oatp2-mRNA表达无相应蛋白表达变化趋势。 结论：(1)痫性发作和AEDs(VPA、CBZ、PHT)均可抑制脑内Oatp2表达，并诱导脑内P-gp表达增加，提示Oatp2在癫痫病理过程中可能存在与P-gp不同的作用；(2)脑内Oatp2蛋白的表达可能存在转录后调控因素，痫性发作和AEDs可能均是影响其基因表达及转录后调控的因子。 第三部分 Oatp2与AEDs关系的体外研究 目的：以体外培养的BMECs作为BBB的体外模型，研究Oatp2对丙戊酸钠的转运作用，及丙戊酸钠等抗癫痫药对BMECs上Oatp2表达的影响 方法：(1)贴块法培养并鉴定脑微血管内皮细胞，免疫细胞化学、Western blot法和RT-PCR法检测Oatp2及P-gp在BMECs上的表达；(2)研究10μg/ml～200μg/ml五个不同VPA浓度及2min～60min五个不同孵育时间对BMECs吸收VPA的影响；(3)研究Oatp2<'+>/Oatp2<'->细胞(BMECs/成纤维细胞)对VPA的吸收；(4)研究Oatp2抑制剂(高浓度地高辛)对VPA吸收的影响；(5)给予不同浓度的VPA、PHT、CBZ持续作用于培养的BMECs，分别在给药后1w及4w用Western blot法检测细胞上Oatp2、P-gp蛋白表达情况。 结果：(1)贴块法获得的BMECs呈多角形或铺路石形，单层贴壁生长。培养细胞Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学、CD<,34>免疫荧光染色均为阳性，细胞纯度90％，且有Oatp2及P-gp表达；(2)BMECs对VPA的吸收具有时间依赖和浓度依赖的特点；(3)Oatp2<'+>细胞(BMECs)对VPA的吸收较Oatp2<'->细胞(成纤维细胞)明显为高(P<0.01)；(4)Oatp2抑制剂可显著抑制：BMECs对VPA的吸收；(5)三种AEDs均可诱导BMECs上Oatp2表达减少，P-gp表达增加，其影响效应与剂量有关。 结论：(1)贴块法可获得原代培养BMECs，方法简便易行，细胞纯度较高，且有转运体Oatp2及P-gp的表达，可作为血脑屏障上转运体的体外研究的模型；(2)BMECs上Oatp2可介导VPA的转运；(3)AEDs可诱导BMECs上Oatp2、P-gp表达变化。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前言

第一部分大鼠体内OATP2表达状况及其年龄特征

1材料和方法

2实验结果

3讨论

小结

第二部分痫性发作及AEDS对脑内OATP2表达的影响

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

第三部分OATP2与AEDS关系的体外研究

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

全文总结

图片资料

参考文献

文献综述 血-脑屏障上的转运体及其对抗癫痫药的跨膜转运

致谢

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