博尔纳病病毒分子流行病学研究——样本采集 病毒检测 种系发生分析 细胞模型建立 试剂盒评价

摘要

　　 WHO公布2003年席卷全球的SARS爆发流行，涉及32个国家和地区，全球累计病例8422例，死亡人数919人，病死率约11％。2004年禽流感病毒甲型H5N1在南亚和东南亚爆发流行，致使超过1亿只家禽被捕杀，并传播人类导致感染患者的死亡。2009年4月自墨西哥出现的第一例甲型H1N1流感病毒感染患者至2010年3月，该病毒的大流行已蔓延全球213个国家和地区。2010年4月，WHO公布迄今为止甲型H1N1病毒大流行已造成17000余人死亡。截至2010年3月31日，中国31个省累计报告甲型H1N1流感确诊病例120000例，死亡病例超过800例。近7年新发感染性疾病（emerging infectiousdisease，EID）事件触目惊心，对人类健康、经济发展和社会稳定产生了巨大的影响，使人们对EID积极防控和健全相关公共卫生安全体系产生了许多新的认识，并对EID病原体给予了高度关注。
　　 目的：
　　 本研究通过BDV分子流行病学调查和研究，建立中国西北伊犁地区新发病毒BDV感染动物样本库，获得BDV流行病学资料，了解不同种属动物BDV流行现状，分析BDV可能的种系来源，为制定预防和控制BDV爆发流行预案提供可靠依据，为健全公共卫生安全体系奠定坚实的基础。同时，建立BDV p40-OL细胞模型，为BDV发病机制的蛋白质组学研究提供平台；进一步评价BDV荧光定量PCR诊断试剂盒，为BDV流行病学调查和临床研究提供可靠的检测手段。
　　 方法：
　　 1.根据BDV感染宿主地源特殊性和种属多样性，选择中国西北新疆伊犁地区作为样本采集地点；伊犁马、新疆驴、新疆双峰驼、天山马鹿和不同品种犬作为样本采集动物；外周血和脑组织作为样本采集对象。
　　 2.采用FQ-nRT-PCR方法，检测8个品种150例犬PBMCs BDVp24 RNA基因片段。用检测BDV p40 RNA片段和质粒pMD19 BDVH1766 p24标准品验证样本BDV p24阳性产物，排除可能出现的假阳性。验证后的阳性产物进行基因测序、核苷酸和氨基酸序列同源比对以及系统发生学分析。
　　 3.在5个种属8个品种873例动物PBMCs中，对伊犁马、新疆驴和哈萨克牧羊犬共检出的19例BDV p24 RNA阳性片段，进行BDV标准株He/80、strain V和H1766比对，分析核苷酸和氨基酸同源相似度，重构基因系统发生树，分析BDV可能的种系来源。
　　 4.培养人OL细胞株细胞，用含有BDV p40基因的质粒pEGFP.N1-BDV p40，经脂质体转染OL细胞。通过G418筛选已转染的0L细胞，获得BDV p40蛋白稳定表达的转染态OL细胞。RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒BDV p40基因表达；观察GFP表达、测定IHC和ELISA，鉴定BDV p40蛋白表达。最后，建立稳定表达BDV p40的转染态OL细胞模型。
　　 5.试剂盒评价在热稳定性评价方面，将BDV p24荧光定量PCR诊断试剂盒中试剂分装多份一次PCR扩增反应量。随机取出其中2份分别置于25℃和37℃两种温度的恒温水浴箱内进行热处理。处理时间分别选择3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h和96 h共7个时间段。在相应温度和热处理时间完成后，对6个浓度梯度的质粒pMD19 BDVH1766 p24标准品进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。通过对PCR反应的CT值和R2值比较，评价试剂盒的热稳定性。在BDV检测信度评价方面，选择定量BDV（+）OL细胞和质粒pMD19BDV H1766 p24标准品，进行BDV p24基因片段PCR扩增。通过比较两种检测对象检出BDV p24浓度梯度的一致性，评价试剂盒病毒检测结果信度。
　　 结果：
　　 1.在样本采集方面，伊犁地区样本采集动物归属于5个种属8个品种。种属包括伊犁马、新疆驴、新疆双峰驼、天山马鹿和犬；品种有哈萨克牧羊犬、德国牧羊犬、卡罗来纳犬、西伯利亚雪橇犬、波音达猎犬、比格猎犬、德国杜宾犬和斗牛梗犬。样本采集动物数量合计897例，其中伊犁马582例，新疆驴204例，新疆双峰驼4例，天山马鹿1例，哈萨克牧羊犬95例，德国牧羊犬28例，卡罗来纳犬14例，西伯利亚雪橇犬8例，波音达猎犬6例，比格猎犬4例，德国杜宾犬3例，斗牛梗犬2例。样本采集对象为外周血、脑组织和全脑。采集样本的数量为外周血样本897份、脑组织样本1573份和全脑样本43份。
　　 2.在病毒检测方面，在8个品种150例犬中，仅哈萨克牧羊犬检出BDV p24片段，阳性率为11.0％（10/91）。基因序列与德国马BDVHe/80和德国绵羊：BDV S6病毒株同源相似度分别为99.2％和95.7％，氨基酸相似度为100％和89.3％。亲缘关系与He/80最近，其次为S6。
　　 3.在种系发生学方面，19例BDV p24核苷酸序列一部分形成伊犁独立支系，其余部分汇聚至伊犁-德国-瑞士混合支系。独立支系与标准病毒株无聚合，核苷酸序列同源相似度为98％，氨基酸序列为100％；德国马He/80汇聚混合支系，核苷酸与氨基酸序列与He/80同源相似度均为100％。
　　 4.在细胞模型建立方面，用RT-PCR扩增经pEGFP-N1-BDV p40转染的OL细胞中BDV p40基因核苷酸序列片段，扩增产物在琼脂糖凝胶电泳154 bp处出现一条清晰的条带，其大小与目的片段一致。倒置荧光显微镜观察，OL细胞核GFP表达量明显大于细胞质（细胞核/细胞质=2.43），证明了BDV p40蛋白核定位的生物学特点。用BDV多克隆抗体和CIC单克隆抗体检测pEGFP-N1-BDV p40、pEGFP-N1和正常OL细胞中BDV p40蛋白表达，结果显示，前者均为阴性，后者均为弱阳性，三者之间无差异。
　　 5.在试剂盒评价方面，试剂盒热稳定评价显示，经25℃和37℃热处理后，各温度7个不同时间段BDV p24 PCR.反应CT值之间无差异，保持正常PCR扩增效率的热处理持续时间范围为3 h～96 h；25℃和37℃两种温度条件下不同时间段平均尺2值之间亦无差异。BDV检测信度评价方面显示，在定量BDV（+）OL细胞（12个浓度梯度即100～10-11）和质粒pMD19 BDV H1766 p24标准品（6个浓度梯度即100～10-5）中，均可检测4个浓度梯度即100、10-1、10-2和10-3，最低检测浓度为10-3。
　　 结论：
　　 1.伊犁地区所采集不同种属和品种的动物血液和脑组织样本量，可基本反映该地区BDV自然感染现状，纳入动物性别和年龄的同质性进一步提高了调查结果的可靠性。在国内外首次建立了马科动物快速开颅全脑采集的新方法。
　　 2.伊犁地区可能存在BDV自然感染，哈萨克牧羊犬为BDV贮存宿主，其自然感染阳性率为11.0％；该地区BDV流行病毒株可能与伊犁马BDV He/80的交叉感染和引进德国Saxony美利奴绵羊BDV S6病毒株的输入感染有关。
　　 3.首次提出了新疆伊犁河谷动物宿主中可能存在地源性BDV独立种系，形成哈萨克牧羊犬BDV KT078和KT079病毒株；同一种系BDV株在伊犁河谷不同种属动物间的感染，可能源于外来疫病病原体经草原丝绸之路的传播。
　　 4.质粒pEGFP-N1-BDV p40转染人OL细胞后BDV p40基因和蛋白在细胞内的稳定表达，建立了转染态BDV p40-OL细胞模型，为探索BDV p40单一病毒蛋白在宿主中的作用和：BDV致抑郁症发病机制的蛋白质组学研究提供了有效的手段。
　　 5.荧光定量BDV p24诊断试剂盒在一定范围内不受温度（25℃/37℃）和在该温度下持续使用时间（3 h～96 h）的限制，具有较好的热稳定性；该试剂盒具有极高的BDV检测信度，可检测宿主细胞中10-3BDV浓度。