2009年重庆地区肠道病毒71型流行株的分离鉴定及病毒基因特征

摘要

手足口病（Hand-foot-mouth disease，HFMD）是由多种肠道病毒引起的一种常见传染病，多发于5岁以下儿童，特别是3岁以下婴幼儿，现已发现20多种肠道病毒可以引起该病，其病原主要为EV71、A组柯萨奇病毒和埃可病毒等肠道病毒。近年来我国部分地区以EV71为主要病原，其神经系统并发症引人关注。重庆地区2008、2009年均出现手足口病流行，本课题前期曾对2009年本地区77例手足口病病原检测显示41例（53％）EV71阳性，6例（8％）CA16阳性，7例（8％）：EV71和CA16均阳性，说明EV71为重庆地区手足口病的主要病原。
　　 目的：对2009年重庆地区手足口病患儿临床标本的EV71进行分离鉴定及全基因组序列测定，并同国内外相关EV71毒株序列进行同源性比对及进化分析，以了解重庆地区EV71流行株基因组序列特征及可能的传播来源。
　　 方法：（1）采集47例手足口病患儿脑脊液、疱疹液、粪便、咽拭子、肛拭子标本共100份，接种于人横纹肌肉瘤细胞（HumanRhabdomyosarcoma，RD）中进行病毒分离培养，对出现细胞病变（Cytopathic Effect，CPE）的细胞上清，分别用肠道病毒通用引物、EV71属特异性引物和柯萨奇A16属特异性引物进行RT-PCR检测，并对PCR产物进行回收克隆测序鉴定，将测序结果在NCBI网站进行Blast分析，同时用生物学软件Bioedit同国际标准BrCr株进行序列比对及同源性分析，同时电镜观察引起细胞病变的病毒形态，以确定所分离的肠道病毒（enteroviruses，EV），的病原EV71。
　　 （2）将鉴定后的2009年重庆地区EV71流行株基因组分4个片段进行RT-PCR扩增，PCR扩增产物纯化后进行基因测序，测序结果拼接成全长基因组序列，利用生物信息学软件对2009年重庆地区EV71流行株序列进行核苷酸、氨基酸比对分析，分析基因亚型并绘制进化树，以鉴定毒株遗传流行变异情况及可能的传播来源。
　　 结果：（1）47例HFMD患儿的100份临床标本接种RD细胞培养中，有7份观察到明显的细胞病变，通过RT-PCR检测有4份呈EV通用引物阳性，有3份EV特异性引物及：EV71特异性引物均阳性，而所有标本CA16特异性引物检测均为阴性，EV71特异性引物PCR产物测序结果证实为EV71病毒，同时用电镜观察形态病毒感染的RD细胞，为20～30nm的圆形无包膜病毒颗粒，与已报道典型的EV71形态相同，证实所分离病毒为EV71。（2）测序获得的3株重庆地区EV71流行株病毒基因组全长分别为7409nt、7406nt和7404nt，3株间VP1氨基酸序列同源性达99％以上，Blast分析表明Chongqing2-09-China（GQ994990.1）、Chongqing-3-09-China（GQ994991.1）均与安徽阜阳2008年分离的3株EV71毒株同源性最高，达97％；Chongqing-1-09-China（GQ994989.1）与2005年台湾分离的984polyprotein、1235 polyprotein序列毒株同源性最高，达96％。3株EV71的VP1氨基酸序列与国内C4亚型代表株AF302996（SHZH98）同源性高达91％以上，证明为C4基因亚型，同时进化树分析也显示其属于C4基因亚型。
　　 结论：（1）本研究成功分离2009年重庆地区EV71流行株。
　　 （2）本实验获得的3株重庆地区EV71病毒基因亚型是C4。