Cyclopamine阻断Hh信号通路对前列腺癌LNCaP细胞PSAmRNA及PCA3mRNA基因表达调控的研究

摘要

前列腺癌为欧美地区男性最常见的恶性肿瘤，死亡率为第二位，仅次于肺癌。我国前列腺癌的发病率低于欧美国家，然而由于生活方式的改变、寿命的增加及诊疗水平的提高，前列腺癌发病率呈显著增长趋势，与欧美国家前列腺癌发生有所不同，我国前列腺癌患者在初诊时大部分已为晚期，丧失了手术机会，内分泌治疗在初期有一定作用，但经过中位时间14-30个月后，几乎所有病变会最终发展为去势抵抗性前列腺癌，尚无有效的治疗方法，中位生存期小于20个月。已成为危害老年男性人群健康的重大疾病。因此寻找新型的治疗晚期前列腺癌的策略和药物，阻止前列腺癌的进展是当前前列腺癌研究的重要内容。目前的研究热点主要集中在雄激素受体、细胞凋亡及细胞周期的调控、基因靶向治疗、肿瘤血管形成等多个方面。但尚没有有意义的进展。近年来分子生物学技术的发展如抑制信号传导，癌基因靶向治疗等为这类前列腺癌提供了新的治疗途径。
　　研究发现Hh信号通路在晚期前列腺癌生长、转移中具有重要作用。Hh信号通路在前列腺癌恶化、临床治疗抵抗和转移中起关键作用，Hh信号通路活性的持续增高会使尚未转移的前列腺癌发生广泛转移，降低该通路的活性可抑制肿瘤的侵袭和转移。因而Hh信号通路抑制剂近年在国内外引起了广泛的关注及研究。Cyclopalmine是从藜芦属植物内分离得到的一种异甾体类生物碱，体内、外实验证实Cyclopamine通过特异性对抗Smo来抑制Hh通路的活性，其机理可能是Cyclopamine与Smo结合，通过改变通路中的Smo空间构象，抑制Smo的活性，从而抑制信号通路，使细胞分裂停止于G0/G1期，抑制细胞增殖，诱导细胞的凋亡，降低了细胞的侵袭力，用Cyclopamine抑制Hh信号通路来研究该通路的作用目前已得到普遍认可。
　　PCA3mRNA基因是近年来发现的前列腺癌最特异性的癌基因之一，高度表达于前列腺癌细胞。在正常前列腺或良性前列腺增生组织中极低表达或不表达，在前列腺以外的其他肿瘤组织及器官中无表达，分析PCA3的表达能区分良恶性组织，在前列腺癌中的过表达能准确量化等优势，将其应用于晚期前列腺癌的靶向基因治疗潜力巨大。
　　PSAmRNA在正常人外周血中不表达，只在表达PSAmRNA的前列腺癌细胞脱落进入血液循环后，外周血中才能检测出PSAmRNA，因而在外周血液中检测出PSAmRNA说明血中存在着前列腺癌细胞，即意味着前列腺肿瘤细胞发生了微转移。研究证实PSAmRNA指标在前列腺癌分期、疗效监测及预后上有重要的意义。如果通过某种治疗能使PSAmRNA的表达下调甚至表达消失，意味着对转移性前列腺癌的治疗有效，而在这方面的研究还属空白。前列腺癌主要通过血液向远处转移，因此血液中转移癌细胞的检测对于前列腺癌转移早期判断、疗效观察及预后判断均具有重要意义。
　　Hh信号通路阻断能否下调前列腺癌PCA3mRNA及PSAmRNA基因的表达?下调PCA3mRNA及PSAmRNA基因表达的影响因素有哪些?Hh信号通路阻断能否成为治疗晚期前列腺癌的一种手段?这些问题正是本课题要解决的。本研究探讨cyclopamine对前列腺癌LNCaP细胞中PCA3mRNA及PSAmRNA基因表达的影响，揭示Hh信号通路阻断对前列腺癌的靶向基因表达的调控及影响条件，为进一步了解靶向基因的表达调控机制和生物学功能及为晚期前列腺癌靶向治疗提供理论依据，同时也为以后的联合用药及动物实验研究奠定理论基础。
　　研究内容：
　　1.观察不同浓度Cyclopamine(1、5、10、15μ mol/L)在不同作用时间(24、48、72h)对前列腺癌LNCaP细胞增殖、凋亡的影响：通过MTT比色法观察Cyclopamine对培养的LNCaP细胞生长增殖的影响；用Hoechst33258染色的方法观察LNCaP细胞凋亡的形态；流式细胞仪及PI染色检测细胞凋亡的变化。
　　2.观察不同浓度Cyclopamine(1、5、10、15μ mol/L)在不同作用时间(24、48、72h)对前列腺癌LNCaP细胞PSAmRNA基因表达的影响：采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法明确Cyclopamine对PSAmRNA基因表达有无影响及与时间、浓度变化之间的关系。
　　3.观察不同浓度Cyclopamine(1、5、10、15μ mol/L)在不同作用时间(24、48、72h)对前列腺癌LNCaP细胞PCA3mRNA基因表达的影响：采用FQ-RT-PCR方法观察Cyclopamine对前列腺癌LNCaP细胞PCA3mRNA基因表达的影响。明确Cyclopamine对PCA3mRNA基因表达有无影响及影响条件。
　　4.提出LNCaP细胞与不同浓度的Cyclopamine共同培养，随着作用时间的延长和药物浓度的增加，PSAmRNA及PCA3mRNA基因表达的变化曲线以及Cyclopamine的最佳调控浓度。
　　5.MTT、流式细胞、Hoechst33258染色试验数据应用统计软件SPSS10.0进行分析，样本均数间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著；FQ-RT-PCR试验结果采用2-△△Ct法进行相对定量，最后取平均值，每个样品的相对表达量的值等于目的基因的表达量均值除以持家基因的表达量均值。数据分析采用SPSS医学统计分析软件进行分析。P<0.05即为差异显著。
　　主要结果：
　　1.MTT法检测显示1μ mol/L的Cyclopamine组对LNCaP细胞增殖无明显抑制作用，与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。5、10、15μ mol/L组对LNCaP细胞增殖有显著抑制作用，与对照组相比差异有显著性(P<0.01)，抑制效果随着浓度增大而增强，其中10μ mol/L组于48 h达到IC50。随着LNCaP细胞与Cyclopamine共同作用时间的延长，细胞生长力明显下降，抑制效果随着时间的延长而增强，与对照组相比有非常显著性差异(P<0.01)。
　　2.Hoechst33258染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈蓝色，而凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。浓度为1μ mol/L时，未见明显的凋亡改变，随着浓度的增加细胞凋亡形态的改变愈发明显，同时对于相同浓度，随着时间的延长，凋亡的改变也逐渐增强。
　　3.流式细胞仪分析结果显示1μ mol/L的Cyclopamine组在24，48，72h凋亡率分别为7.69％，7.56％，5.73％；5μ mol/L组凋亡率分别为7.81％，7.37％，8.27％；10μ mol/L组凋亡率分别为37.21％，57.38％，57.98％；15μ mol/L组凋亡率分别为21.16％，71.31％，72.90％。与对照组相比有极显著性差异(P<0.01)，1μ mol/L组与5μ mol/L组在24，48，72h的细胞凋亡率比较没有显著性差异(P>0.05)；1、5μ mol/L组与10、15μ mol/L组细胞凋亡率比较有极显著性差异(P<0.01)；10μ mol/L组和15μ mol/L组24h凋亡率与48，72h凋亡率比较有显著性差异(P<0.05)。AV-PI双染后荧光显微镜下观察凋亡形态随着Cyclopamine浓度增大和作用时间的延长细胞凋亡形态的改变也逐渐显著。
　　4.FQ-RT-PCR检测PSAmRNA基因表达的结果：1，5，10，15μ mol/L四个不同浓度经过24，48，72h刺激，PSAmRNA基因的表达呈现递减趋势，与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。而且三个时间段检测显示PSAmRNA基因的表达具有差异性(P<0.05)，值得注意的是在浓度为10和15时PSAmRNA基因的表达量极低。
　　5.FQ-RT-PCR检测PCA3mRNA基因表达的结果：将Cyclopamine以1，5，10，15μ mol/L四个不同的浓度经过24，48，72h刺激前列腺癌LNCaP细胞，PCA3mRNA基因的表达表达水平均较空白对照组显著降低(P<0.01)，随着浓度的上升，PCA3基因的表达呈现递减趋势，差异显著。值得注意的是浓度为10μ mol/L时在不同时间段PCA3基因的表达均极低。
　　主要结论：
　　1.Cyclopamine能够明显抑制LNCaP细胞的增殖，诱导细胞凋亡。细胞凋亡率随Cyclopamine浓度增大和作用时间的延长而增加，呈时问-浓度依赖关系。调节Hh信号通路活性将为晚期前列腺癌的治疗提供新的思路和方向。
　　2.Cyclopamine能够显著下调LNCaP细胞PSAmRNA基因的表达。PSAmRNA基因的表达随着Cyclopamine浓度增大而明显降低，10，15μmol/L浓度的效果极为显著；作用时间延长对表达的影响不是很显著。一定浓度Cyclopamine可能对转移性前列腺癌的治疗有效。
　　3.Cyclopamine能够明显降低LNCaP细胞PCA3mRNA基因的表达。PCA3mRNA基因的表达随着Cyclopamine浓度增大和作用时间的延长而显著降低，10μ mol/L浓度的效果极为显著。一定浓度的Cyclopamine可能对晚期前列腺癌的治疗有效。
　　4.Cyclopamine阻断Hh信号通路能够明显降低LNCaP细胞PCA3mRNA、PsAmRNA基因的表达，尤其当浓度为10μ mol/L时效果极为显著。Hh信号通路阻断将为晚期前列腺癌的治疗提供新的思路和方向。