HBX通过调节mir-101影响DNMT3A导致HBV相关性HCC发生的分子机制

摘要

目的:探讨HBX调节miR-101的表达在HBV相关性肝癌发生发展中的分子机制。
　　方法:采用Real-time PCR方法检测HBV相关性肝癌组织标本和肝癌细胞目的基因的mRNA表达水平及运用Western blot方法检测HBV相关性肝癌组织标本和肝癌细胞目的基因的蛋白表达水平;运用体外双荧光素酶报告基因检测miR-101与其靶基因DNMT3A的结合情况;通过体外转染的方法研究miR-101的相关功能。
　　结果: miR-101在表达HBX的肝癌细胞株呈现低表达，miR-101在HBV相关性肝癌组织比相应的癌旁组织表达降低，且miR-101的表达量与DNMT3A的mRNA表达呈负相关;双荧光素酶报告系统证明miR-101可以通过直接与DNMT3A的3'-UTR区发生互补结合，从而抑制其mRNA和蛋白表达水平;HBX通过miR-101调节DNMT3A影响抑癌基因的甲基化而调控其表达。
　　结论:本实验证明了HBX通过调节miR-101参与了HBV相关性肝癌发生的表观遗传学调控，不仅为HBV相关性肝癌的发病机制提供了新的视角，也将为HBV相关性肝癌的分子靶向的治疗提供新的依据。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

1 材料

1．1 细胞株

1．2 组织样本

1．3 主要实验试剂与仪器

2 方法

2．1 细胞培养

2．2 siRNA和miRNA的合成

2．3 细胞转染

2．4 载体构建

2．5 点突变载体构建

2．6 DNA测序

2．7 总RNA提取

2．8 RT-PCR

2．9 实时荧光定量PCR

2．10 双荧光素酶检测分析

2．11 Western blot分析

2．12 细胞基因组DNA的提取

2．13 DNA的亚硫酸氢盐修饰

2．14 甲基化特异性PCR

2．15 统计学方法

3 结果

3．1 在表达HBX的人HCC细胞中miR-101的表达量显著下调

3．2 HBX可以上调DNMT3A的表达

3．3 DNMT3A是miR-101的靶基因

3．4 miR-101可以抑制DNMT3A的表达

3．5 miR-101在HBV相关性HCC组织中显著下调

3．6 HBV相关性HCC组织中miR-101与DNMT3A mRNA的表达水平呈负相关

3．7 人HCC细胞中DNMT3A的表达量改变并不会影响miR-101的表达

3．8 在HepG2细胞中抑制miR-101的表达可以增加肿瘤抑制基因的启动子区甲基化水平

3．9 在HepG2．2．15细胞中增强miR-101的表达可以降低肿瘤抑制基因的启动子区甲基化水平

4．讨论

全文总结

参考文献

文献综述 HBX与miRNAs在HBV相关性肝癌中的作用

致谢

攻读硕士学位期间发表论文及科研学术活动