人类EBLN1基因生物学功能、作用机制及其与抑郁症的关系初探

摘要

背景:
　　近年研究发现许多病毒能成为其宿主遗传物质的一部分，由病毒DNA（或病毒RNA的DNA拷贝）整合于宿主生殖细胞而产生，这种现象被称为“内生化(endogenization)”，其整合序列称为内源性病毒序列(endogenous viral elements，EVEs)。最初人们以为只有逆转录病毒存在整合入基因组而内生化的现象，后来的研究陆续发现，在真核生物基因组中除逆转录病毒外还存在DNA病毒、甚至RNA病毒留下的整合序列，分别称之为内源性逆转录病毒(Endogenous Retrovirus，ERV)、内源性DNA病毒、非逆转录整合RNA病毒(Non-retroviralIntegrated RNA Virus，NIRV)。这些EVEs的形成、进化过程、潜在功能引起了科学家们的极大兴趣。
　　2010年1月，Horie等在Nature刊文报道在包括人类在内的多种哺乳动物基因组中发现存在与博尔纳病病毒(Borna disease virus，BDV)N基因具有同源性的片段，称之为内源性博尔纳样核蛋白序列(EBLN)。这是首个报道的存在于哺乳动物包括人类基因组中的NIRV。存在于人类基因组中的EBLN有四个，分别命名为EBLN1、 EBLN2、 EBLN3、 EBLN4，其中EBLN1与BDV N氨基酸序列相似性最高，为58％。通过基因序列分析发现EBLN1存在一个长开放读码框(ORF)，可编码366个氨基酸，与含370个氨基酸的BDV N蛋白长度相当接近，且这些ORF在其他简鼻亚目灵长类物种中亦呈相对保守。人类表达序列标签(EST)数据库中可检测到EBLN1。此外，EBLN1基因已被证实在OL、293T、MOLT4等人类细胞系中存在转录。这些线索均提示EBLN1基因可以编码蛋白质，很可能为有功能的结构基因。然而，EBLN1作为一个新发现的NIRV基因，目前人们对其基本结构表达特征仍知之甚少，缺乏系统全面的了解，且其发挥的具体生物学功能，是否与疾病发生有关目前仍不清楚。
　　BDV是一种代表性且研究最多的与精神疾病有关的病毒，属于非分节段单股负链有包膜RNA病毒，具有高度的嗜神经性，为单分子负链RNA病毒目博尔纳病毒科博尔纳病毒属的唯一成员，其一个显著特征为核内复制转录。近年来国内外的大量流行病学调查、病例对照研究、病毒分离及临床实验研究结果提示BDV与重性抑郁、双相情感障碍等精神疾病发病密切相关，揭示BDV很可能为人类精神疾病的风险因子。此外，BDV的一个独特特征为主要侵犯边缘系统尤其是海马，感染动物可引起焦虑、学习记忆障碍、过度兴奋等精神行为异常和发育障碍症状，类似于人类情感障碍、精神分裂症及孤独症等疾病。正因为BDV感染与精神疾病包括抑郁症的发生存在的密切关系，在2008年的国际博尔纳病病毒研究会议上BDV作为“情感病毒”这一概念被提出。
　　与NIRV同属EVE的人类内源性逆转录病毒HERV，最早于1970年代初期即被发现，现已有较多相关研究。人类基因组计划发现HERV约占了整个基因组的8％，有较多报道提示HERV具有编码基因的表达参与胚胎发育、免疫抑制、细胞分化等宿主细胞生理功能、对其他基因的顺式调控作用以及发挥抗病毒免疫作用。另外还发现HERV与人类关系密切且其异常表达可能参与多种疾病。例如可能参与一些自身免疫性疾病、精神分裂症、一些肿瘤的发生发展。
　　总之，EBLN1与BDV P40蛋白氨基酸序列具有58％的相似度，呈高度同源性，可能具有相似的生物学功能及致病性。EBLN与HERV同属内源性病毒序列，皆是外源性病毒感染宿主后整合入宿主基因组内的病毒“化石”，有理由推测两者具有类似的生物学特性，EBLN可能也与HERV一样其表达异常与疾病发生有关。此外，文献报道已证实EBLN1可在OL神经细胞株中呈较高水平转录表达。基于以上线索，我们推测EBLN1可能具有一些重要的生物学功能，并参与抑郁症的发生发展，成为联系BDV感染与抑郁症的一个重要桥梁。
　　目的:
　　初步探讨EBLN1基因的基本功能、作用机制及其在抑郁症中可能发挥的作用，并试图探讨EBLN1基因SNP多态性与抑郁症的关联性，从而明确EBLN1是否为抑郁症的一种新易感基因，以为BDV与抑郁症关系提供分子遗传学证据，为后续深入认识这一新的NIRV基因奠定基础，并为进一步阐明BDV感染与人类精神疾病尤其是抑郁症的内在联系提供线索。
　　方法:
　　1、本研究首先采用RT-PCR检测EBLN1基因在SY5Y、U87、OL、293T、PBMC五种人各种类型细胞中的转录表达谱。然后从OL细胞中提取总RNA，分别利用5'-RACE和3'-RACE技术克隆人EBLN1基因全长cDNA序列，并对其开放读码框和非翻译区结构以及编码氨基酸进行初步分析预测。
　　2、构建EBLN1 RNA干扰慢病毒载体并进行病毒包装，用两种BDV病毒株分别平行感染EBLN1 RNA干扰组及对照组OL细胞后，应用基于Taqman探针法RT-qPCR、WB、FFU三种方法分别检测BDVP24/P40基因、蛋白含量及病毒滴度，以评价EBLN1对OL细胞感染两种BDV病毒株的易感性的影响。然后采用基于慢病毒介导的RNA干扰技术通过MTT、Transwell、划痕实验观察EBLN1基因在细胞增殖、迁移、运动这些基本生物学功能中的作用。并通过基因芯片方法系统筛查EBLN1可能影响的下游基因。
　　3、收集抑郁症患者及健康对照PBMC样本各94例，提取总RNA，采用基于2-△△Ct相对定量分析的SYBR Green法RT-qPCR检测EBLN1基因的转录水平，用GAPDH作为内参矫正。比较组间是否存在统计学差异，以明确EBLN1基因表达与抑郁症的关联性。
　　4、纳入抑郁症患者389例，健康对照者301例，提取全血DNA，采用PCR直接测序方法筛选中国重庆地区人群中EBLN1基因SNP位点，并对筛选出的位点在抑郁症与健康对照组中进行SNP关联分析。
　　结果:
　　1、采用RT-PCR方法检测EBLN1基因的转录表达谱，结果发现该五种类型细胞中均存在EBLN1转录产物。通过RACE技术，得到了EBLN1基因的全长cDNA，且发现比Genbank数据库中已知序列更长，存在5'UTR部分序列。
　　2、EBLN1 RNA干扰组中在大部分时间点两种病毒株P24/P40基因、蛋白含量及病毒滴度分别均显著高于相应对照组（P＜0.05），三种方法检测呈现较一致的趋势。EBLN1RNA干扰慢病毒感染OL细胞后，与阴性对照病毒比较，MTT结果显示从第2天开始至第5天，其细胞增殖数量显著降低（P＜0.05），Transwell实验显示20小时后其细胞迁移率显著降低(P＜0.05)，划痕实验显示形成划痕6小时、20小时后迁移率均显著下降，提示细胞愈伤能力受到影响（P＜0.05）。通过基因芯片分析EBLN1 RNA干扰组及对照组OL细胞，筛选出1067条上调基因，2004条下调基因。Pathway分析提示RNA干扰EBLN1后引起多个信号通路改变，其中较显著的有细胞周期、MAPK、P53、凋亡等相关通路。
　　3、抑郁症组PBMC中EBLN1 mRNA水平显著低于对照组，约为对照组的1/4，且有统计学差异(P＜0.001)。
　　4、PCR直接测序方法筛选中国重庆地区人群中EBLN1基因SNP位点结果显示，未发现中国重庆地区人群中EBLN1基因存在SNP变异以及EBLN1SNP基因多态性与重性抑郁存在关联性的证据，
　　结论:
　　1、证实EBLN1基因在人体各组织细胞类型中广泛表达，尤其在三种类型神经细胞中呈较高水平表达，提示EBLN1基因可能在神经系统生理功能发挥重要作用，并通过RACE技术得到了cDNA全长序列，这些结果为后续开展EBLN1的生理功能及与疾病相关性研究提供了线索与依据。
　　2、发现了EBLN1的抗BDV病毒免疫及促进细胞增殖、迁移、愈伤能力的作用，并通过基因芯片方法系统筛查了EBLN1可能影响的下游基因，并推测MAPK、P53及细胞周期通路或RND3基因的上调参与了EBLN1促进OL细胞增殖迁移的作用，对理解认识EBLN1的生物学功能及作用机制进行了初探。
　　3、证实抑郁症患者PBMC中EBLN1基因转录水平发生下调，预示EBLN1基因可能起抗抑郁作用。
　　4、未发现中国重庆地区人群中EBLN1基因存在SNP变异以及EBLN1 SNP基因多态性与重性抑郁存在关联性的证据，提示抑郁症患者中EBLN1基因转录水平改变可能不是由其基因多态性引起。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 EBLN1基因研究基础工作

前言

第一章 EBLN1基因在人各种细胞株的表达分布

1 材料与方法

2 结果

第二章 EBLN1基因全长cDNA序列获取

1 材料与方法

2 结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 EBLN1基本生物学功能及基因芯片分析

前言

第一章 EBLN1 RNAi慢病毒载体构建和包装

1 材料与方法

2 结果

第二章 EBLN1生物学功能研究

1 材料与方法

2 结果

第三章 RNA干扰EBLN1基因对OL细胞影响的基因芯片分析

1 材料与方法

2 结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 EBLN1基因表达与抑郁症相关性研究

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第四部分 EBLN1基因多态性与抑郁症易感性关系研究

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述 非逆转录整合RNA病毒研究进展

致谢

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