人EBLN1基因系统进化分析及其生物学功能研究

摘要

背景：人内源性逆转录病毒(human endogenous retroviruses，HERV)是在病毒感染过程中，其DNA整合到人类基因组并经过长期遗传而产生的。人类基因组中约8%的基因来自于内源性逆转录病毒。HERV参与胚胎发育、免疫调节等多种人体正常生理功能。在分子水平上，HERV可通过多种方式参与基因表达调节，如启动子、增强子或沉默子、多聚腺苷酸化信号、各种核蛋白结合位点。研究表明，HERV的异常表达与人类某些疾病的发生密切相关，主要包括神经精神疾病、癌症和免疫性疾病。如HERV-W1在多种恶性肿瘤中呈高表达和异常活化。因而，深入研究 HERV的生物学功能有利于揭示人类疾病的致病机制，HERV有望成为治疗的新靶点。
　　EBLN(endogenous borna-like N elements)与博尔纳病病毒(borna disease virus,BDV)核蛋白(P40)具有高度同源性的内源性非逆转录病毒。迄今为止，在人类基因组中已经发现7个EBLNs，分别命名为EBLN1～EBLN7。其中，EBLN1与BDV N蛋白氨基酸序列的同源性最高。目前人们对EBLN1的生物学功能了解甚少。
　　已证实，EBLN1不仅高表达于293T、MOLT4细胞，而且在少突胶质(oligodendroglia,OL)细胞、神经母细胞(SY5Y)、人胶质瘤细胞(U87)等神经肿瘤细胞中也呈高表达。提示EBLN1可能在维持神经肿瘤的恶性表型中具有重要作用。
　　BDV是一种单股负链RNA病毒，包含6个开放阅读框(open reading frame,ORF)，至少表达6个病毒蛋白(N、P、X、L、G和M)，其中蛋白N(P40)和P(P23)是BDV致病的关键因子。BDV具有高度嗜神经性，主要侵犯边缘系统。动物实验表明，BDV感染可引起宿主行为异常、情绪异常和学习记忆障碍。流行病学调查表明，BDV感染率在精神分裂症、双相情感障碍等神经精神疾病的患者明显高于正常对照组。BDV可能是人类神经精神疾病的致病之一。由此推测，EBLN1的生物学功能可能也与神经系统有关。
　　目的：
　　1、在完成对5个BDV病毒株(Hu-H2、HUSA1、Dessau、Cresalo和WR3)全基因组测序的基础上，分析EBLN1与人源性BDV N基因的系统进化关系。
　　2、观察RNAi技术抑制EBLN1后OL细胞、SY5Y细胞、U87细胞生物特性的变化，以探讨EBLN1在神经肿瘤中的作用。
　　3、观察EBLN1蛋白表达对海马神经元的影响及对大鼠学习记忆能力的影响，以探讨EBLN1蛋白在神经系统中的生物学功能。
　　方法：
　　1、采用RT-PCR技术扩增5个BDV病毒株的全基因组序列；用DNAMAN软件将5个病毒株全序列与从GenBank中获取的BDV全长序列进行同源性比较；用MEGA软件构建系统进化树。同时进行EBLN1与人源性BDV N基因进行同源性比较和系统进化分析。
　　2、构建EBLN1干扰慢病毒载体，感染OL细胞、SY5Y细胞、U87细胞，分别进行细胞增殖，凋亡、细胞周期、体外克隆、划痕和Transwell等实验，以评价EBLN1干扰对神经肿瘤细胞生物学特性的影响。qRT-PCR检测EBLN1干扰对OL细胞基因表达的影响。Western blotting检测周期和凋亡相关蛋白表达水平。
　　3、构建EBLN1表达的慢病毒载体和腺相关病毒载体，分别感染海马神经元和大鼠海马定位注射。免疫荧光检测EBLN1蛋白的细胞定位。基因芯片检测EBLN1蛋白对神经元基因表达的影响。Western blotting检测突触可塑料性相关蛋白的水平。水迷宫实验评价大鼠的学习记忆能力。
　　结果：
　　1、来自不同宿主的5个BDV病毒株(Hu-H2、HUSA1、Dessau、Cressalo和 WR3)的全基因组扩增和测序。进一步分析得出，人源性BDV病毒株与非人源性病毒株之间的同源性为98.07～99.97%；人源性BDV病毒株在亲缘关系上具有地域特征。此外，EBLN1与人源性BDV N基因的同源性为47.6%～50.82%，并且与来自德国病人BDV N基因具有紧密的亲缘关系。
　　2、EBLN1干扰能够导致OL、SY5Y和U87细胞生物特性的改变，分别表现为：OL细胞增殖受抑、凋亡增加，体外克隆形成减少；SY5Y细胞运动迁徙能力减低；U87细胞增殖受抑、凋亡增加、体克隆形成减少，同时运动迁徙能力减低。EBLN1干扰OL细胞后，3个与胶质细胞瘤的增殖和凋亡密切相关的基因RND3、OSMR和CREB3L2呈高表达。EBLN1干扰OL细胞后，凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达明显减低。而Bax、caspase3和P53的表达在EBLN1干扰前后无明显差异。
　　3、EBLN1蛋白定位于胞浆。EBLN1蛋白在神经元表达后，检测到有显著表达差异的基因170个，上调基因10个，如NEFM、CCDC148、GPR85等；下调基因160个，包括DES、ABCD5、GOLGA6C、ANXA2、PARP4等。GO富集分析发现，差异基因的功能主要集中在细胞周期、RNA转录调控、染色体的固缩和分离等。KEGG分析发现，差异基因主要与核糖体信号通路有关。同时，EBLN1蛋白可导致神经元突触相关蛋白PSD95和pERK的表达水平增加。然而，水迷宫实验发现EBLN1蛋白表达前后，大鼠的学习记忆能力无明显影响。
　　结论：
　　1、人源性BDV病毒株与非人源性BDV病毒株之间具有很高的同源性。BDV病毒在亲缘关系上具有地域性。EBLN1与人源性BDV病毒株具有紧密的亲缘关系。
　　2、EBLN1干扰能逆转神经肿瘤细胞的恶性表型，提示EBLN1在神经肿瘤中具有促癌基因的作用。
　　3、EBLN1蛋白可导致突触可塑性相关蛋白和信号通路活化，但其对学习记忆功能的影响尚需进一步研究证实。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

一、EBLN1可能与神经肿瘤密切相关

二、EBLN1可能与神经精神疾病有关

参考文献

第一部分 人EBLN1基因的系统进化分析

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分 人EBLN1基因在神经肿瘤中的作用

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第三部分 人EBLN1蛋白生物学功能的初步研究

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

全文总结

文献综述：内源性逆转录病毒与人类疾病的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的论文