高强度聚焦超声对溶菌酶结构、活性的影响

摘要

高强度聚焦超声（High intensity focused ultrasound，HIFU）是一种新型的微无创治疗技术，已在临床应用中展现出巨大的优势。HIFU治疗的主要作用机制包括热效应、机械效应以及空化效应等。目前，关于HIFU对蛋白质结构、活性的影响的报道少之又少。因此，本文使用溶菌酶作为研究蛋白，利用质谱、圆二色光谱（CD光谱）、荧光光谱、核磁共振氢谱(1H-NMR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及被动空化检测（Passive Cavitation Detection PCD）等方法，研究了HIFU处理溶菌酶后对溶菌酶结构、活性的影响，并初步探讨了HIFU影响蛋白质结构、活性的作用机制。
　　目的:
　　1.探讨高强度聚焦超声对一种蛋白质—溶菌酶结构、活性的影响，以及相应的辐照参数。
　　2.从声空化和温升的角度探讨高强度聚焦超声对溶菌酶结构、活性影响的机制。
　　方法:
　　1.分别使用频率0.94 MHz、声功率500W、脉冲重复频率4 Hz、占空比10％的脉冲高强度聚焦超声辐照溶菌酶溶液10s、2min、3min、4min、5min。以及使用频率0.94 MHz、声功率分别为100W、200W、300W、400W、500W，脉冲重复频率4 Hz、占空比10%的脉冲高强度聚焦超声辐照溶菌酶溶液5min。4oC保存备用。
　　2.利用质谱、圆二色光谱（CD光谱）、荧光光谱、核磁共振氢谱(1H-NMR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法，研究高强度聚焦超声对溶菌酶结构的影响。采用溶菌酶试剂盒测定辐照前后溶菌酶活性的变化情况。
　　3.采用PCD系统采集HIFU辐照过程中焦域处的声发射信号（acoustic emissions，主要为空化信号），对该信号进行快速傅立叶变换（Fast Fourier Transformation，FFT）然后进行带通滤波（3~7MHz）后用带阻滤波器滤除通带内的谐波（3f0、4f0、5f0、6f0、7f0），得到非谐波的宽带噪声，然后对宽带噪声进行均方根（Root Mean Square，RMS）运算，得到RMS随辐照时间的变化曲线。进而得到辐照过程中的累积空化剂量（ICD）。
　　4.使用温度采集系统记录HIFU辐照中焦域处的温度，并绘制其随辐照时间变化的曲线。
　　结果:
　　1.高强度聚焦超声处理后，质谱无明显变化，表明超声对溶菌酶一级结构无影响；CD光谱无明显变化，表明超声对溶菌酶二级结构无影响；而荧光光谱显示，荧光强度减弱，且荧光强度随着HIFU辐照功率、辐照时间的增加逐渐减弱。说明溶菌酶色氨酸（Trp）周围的疏水结构发生了变化，且随着 HIFU辐照功率、辐照时间的增加，疏水结构进一步被破坏；SDS-PAGE结果显示，经超声辐照后溶菌酶出现支链降解，且随着HIFU辐照功率、辐照时间的增加，目标条带逐渐变细变淡；1H-NMR结果显示，经超声辐照后溶菌酶色氨酸发生了化学位移，且随着HIFU辐照功率、辐照时间的增加，化学位移也有所增加。
　　2.高强度聚焦超声处理后，溶菌酶活性均出现降低现象。且随着HIFU辐照功率、辐照时间的增加，溶菌酶活性逐渐降低，由最初的200U/ml下降到23.2U/ml。
　　3.HIFU辐照过程中，存在空化现象，且随着辐照功率的增加，累积空化剂量随之增加，表现在溶菌酶结构方面的影响，色氨酸荧光强度随之减弱，化学位移随之增加。表现在溶菌酶活性方面的影响，溶菌酶的活性逐渐减弱。
　　4.HIFU辐照过程中，焦域处温度变化幅值不大,初始温度18oC， HIFU辐照产生的最高温度为23.3oC，其温度的变化不足以引起溶菌酶变性。
　　结论:
　　1、实验结果表明高强度聚焦超声可以改变溶菌酶的高级结构，即溶菌酶的三级、四级结构。但对于溶菌酶的一级、二级结构无明显改变。这可能与超声参数、蛋白质本身的超声耐受性不同有关。
　　2、HIFU辐照溶菌酶后，溶菌酶的活性降低，且随着辐照时间增长、辐照功率增加活性越来越弱。
　　3、HIFU辐照过程中存在空化现象，空化产生的自由基，主要是羟基、游离氢原子会引起蛋白质表面电荷分布，使得蛋白质活性降低。

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英文摘要

前言

第一章 高强度聚焦超声对溶菌酶结构的影响

1材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验设备

1.3实验装置图

2实验结果

2.1 紫外吸收光谱

2.2 CD光谱分析

2.3 荧光光谱分析

2.4 核磁共振氢谱分析

2.5 SDS-PAGE分析

2.6 质谱分析

讨论

小结

第二章 高强度聚焦超声对溶菌酶活性的影响

1 材料与方法

1.1实验材料

1.2 实验方法

2结果

2.1不同作用时间对溶菌酶活力的影响

2.2不同功率辐照对溶菌酶活力的影响

3讨论

小 结

第三章 高强度聚焦超声辐照溶菌酶过程中的空化与温升

1材料与方法

1.1实验材料

1.2实验设备

1.3实验方法与步骤

1.4实验结果的处理

2 实验结果

2.1辐照过程中，脉冲信号图谱

2.2 HIFU辐照中的空化频谱信息

2.3各辐照功率参数下空化“on”时间段RMS值

2.4 HIFU辐照中焦域处的温升

全文总结

参考文献

文献综述: 超声在生物医学中的应用

致谢

攻读学位期间发表的学术论文