烟草提取物通过TGF-β1/SMAD2通路诱导RLE-6TN细胞凋亡

摘要

目的：研究烟草提取物(CSE)对体外培养的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的影响并探究其中的潜在机制。
　　方法：
　　1.体外培养大鼠肺泡上皮RLE-6TN细胞株24h后，分别加入0.5％，1.0%和2.0%CSE共培养48h，Hoechst染色法检测烟草提取物对细胞核变化的影响；流式细胞术检测细胞早期凋亡率；蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测转化生长因子(Transforming Growth Factor-beta1,TGF-β1)，smad2的表达量和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3裂解片段(Cleaved caspase-3)的活性。
　　2.TGF-β1受体抑制剂(SB431542)500nmol·L-1作用RLE-6TN细胞株24h后，加入2.0% CSE共培养48h。Western blot分别检测Smad2和Cleaved caspase-3的活性。
　　结果:
　　1.经不同浓度的CSE(0.5%，1.0%，2.0%)作用RLE-6TN细胞48h后，经Hoechst染色后，各CSE处理组均可见部分凋亡细胞，胞核发白、固缩、染色质边集等现象，对照组细胞核呈现均匀的淡蓝色荧光。随机视野内凋亡细胞百分数分别为：对照组(3.671±1.04)%，0.5%CSE处理组(16.606±6.645)%，1.0%CSE处理组(18.626±3.596)%以及2.0%CSE处理组(31.035±4.373)%,各CSE处理组凋亡细胞百分数较对照组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.流式细胞术发现细胞早期凋亡率分别为：对照组(5.270±0.526)%,0.5%CSE处理组(22.563±1.048)%，1.0%CSE处理组(27.467±0.735)%以及2.0% CSE处理组(32.580±0.413)%，各CSE处理组细胞早期凋亡率与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3. Western Blot结果显示各CSE处理组TGF-β1、Smad2、磷酸化smad2(p-Smad2)蛋白表达量与Cleaved caspase-3活性较对照组明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.经TGF-β1受体抑制子(SB431542)干预48h后，SB431542干预组p-Smad2蛋白表达量及Cleaved caspase-3活性较对照组显著下降(P<0.05)；SB431542+2.0% CSE处理组p-Smad2蛋白表达量及Cleaved caspase-3活性较2.0%CSE处理组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论:
　　1. CSE可激活TGF-β1/Smad2信号通路，诱导肺泡上皮细胞凋亡。
　　2. TGF-β1受体抑制子SB431542可阻断TGF-β1/Smad2信号通路,并能逆转CSE诱导的肺泡上皮细胞凋亡执行蛋白活性升高。故CSE通过激活TGF-β1/Smad2信号通路,参与调节Cleaved caspase-3的活性，从而诱导大鼠肺泡上皮细胞的凋亡。

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封面

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

1 材料和方法

1.1细胞培养

1.2细胞培养液的配制

1.3主要实验药物

1.4主要实验试剂

1.5主要实验仪器

1.6其他试剂与耗材

1.7常用溶液配制

1.8烟草提取物的制备

1.9 Hoechst染色检测细胞凋亡的形态学改变

1.10 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡

1.11 Western blot检测TGF-β1，Smad2，p-Smad2和Cleaved caspase-3蛋白的表达

1.12 TGF-β1受体抑制剂SB431542阻滞TGF-β1/Smad2信号通路

1.13统计学分析

2结果

2.1 CSE对RLE-6TN细胞核形态的影响

2.2 CSE对RLE-6TN细胞凋亡的影响

2.3 CSE对RLE-6TN细胞TGF-β1/Smad2信号通路及Cleaved caspase-3蛋白活性影响

2.4抑制TGF-β1/Smad2信号通路对烟草烟雾提取物诱导的RLE-6TN细胞Cleaved caspase-3蛋白活性的影响

3 讨论

附图

全文总结

参考文献

文献综述:烟草危害与呼吸系统疾病

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文情况