扇贝多肽调节NO/TGF-β/smad2,smad3/smad4通路抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡

摘要

目的：复制20mJ·cm-2UVB诱导的HaCaT细胞凋亡模型、iNOS瞬时转染HaCaT细胞模型，从诱导型一氧化氮合酶(iNOS)/一氧化氮(NO)角度、转化生长因子β(TGF-β)/信号转导分子(Smads)，研究扇贝多肽(Polypeptide from Chlamysfarreri，PCF)抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡的分子机制。
　　 方法：复制20mJ·cm-2UVB诱导HaCaT细胞凋亡模型。利用阳离子脂质体(LipefectimeTM2000)法建立iNOS瞬时转染HaCaT细胞模型。实验设计分组:对照组、UVB模型组、UVB+TGF-β受体抑制剂SB431542组、UVB+iNOS特异性抑制剂SMT组、UVB+NO清除剂Carboxy-PTIO组、UVB+1.42～5.69 mmol·L-1PCF组、iNOS瞬时转染组。Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡率;Real-Time PCR检测TGF-β、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA的经时(0、3、6、10、12、15、18、24 h)表达;蛋白质印迹法检测TGF-β、p-Smad2/Smad3、iNOS在UVB辐射损伤HaCaT细胞后细胞内的经时(0、3、6、10、12、15、18、24 h)变化。
　　 结果：Hoechst33258荧光染色检测UVB损伤HaCaT细胞后18h的凋亡率约为40％; mRNA的经时表达显示UVB辐射后Smad2和Smad3表达量与辐射前相比差异无统计学意义(P＞0.05)，Smad4 mRNA表达于12h开始升高，而Smad7 mRNA表达于0h升高后下降，12h达高峰;蛋白经时变化显示TGF-β于20mJ·cm-2UVB照射后孵育3h可检测到表达量达峰后下降(P＜0.01)，18h达第二次高峰，而p-Smad2/Smad3在UVB照射后孵育3h开始升高，12h，15h蛋白表达量达高峰(P＜0.01);iNOS蛋白表达6h开始升高，18h，24h达高峰;iNOS瞬时转染模型中，TGF-β蛋白表达与非转染组相比显著升高(P＜0.01);10μmol·L-1 SB431542、1 mmol·L-1 SMT、100μ mol·L-1Carboxy-PTIO与1.42～5.69mmol·L-1剂量范围内的PCF均明显抑制UVB引起的HaCaT细胞凋亡(P＜0.05); UVB辐射前预先加入SB431542使p-Smad2/Smad3的表达量降低(P＜0.05);1.42～5.69 mmol-L-1PCF可剂量依赖性抑制TGF-β、Smad4 mRNA，TGF-β、p-Smad2/Smad3和iNOS蛋白的表达，抑制NO的释放(P＜0.05)。
　　 结论：PCF可抑制20mJ·cm-2UVB诱导的HaCaT细胞凋亡，其作用机理是通过调节NO/TGF-β/Smad2，Smad3/Smad4通路。

目录

摘要

引言

第一章 实验材料

1．1 主要试剂与材料

1．2 细胞株、带质粒DNA的菌株

1．3 仪器设备

第二章 实验方法

2．1 实验设计与模型建立

2．2 试验项目与指标检测

2．3 统计学处理

第三章 实验结果

3．1 Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡率

3．2 UVB照射HaCaT细胞内TGF-β，smad2，smad3，smad4，smad7 mRNA表达的经时变化

3．3 UVB照射HaCaT细胞内TGF-β、p-smad2／smad3以及iNOS蛋白表达的经时变化

3．4 加药组UVB照射的HaCaT细胞内TGF-β，smad4，smad7 mRNA表达的影响

3．5 加药组UVB照射的HaCaT细胞内TGF-β、p-smad2／smad3以及iNOS蛋白表达的影响

3．6 iNOS瞬时转染HaCaT细胞的鉴定，TGF-β蛋白表达

第四章 讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

致谢

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