原发免疫缺陷病DOCK8缺陷综合征及IKBKB缺陷疾病的发病机制探讨

摘要

第一部分 DOCK8缺陷状态下滤泡辅助 T细胞产生 IL-21调节 IgE的机制研究
　　背景：高 IgE综合征(Hyper-IgE syndrome, HIES)是一组常染色体遗传的原发性免疫缺陷病，其中常染色体隐性遗传(AR)的DOCK8免疫缺陷综合症(Dedicator of cytokinesis8 immunodeficiency syndrome, DIDS;OMIM243700)是一种以特应性皮炎、反复、慢性皮肤病毒感染和呼吸道感染症状、血清 lgE升高和嗜酸性粒细胞增多为特征的原发性免疫缺陷疾病。DOCK8基因定位于人类9号染色体p24.3，其编码的 DOCK8蛋白可激活Rho-GTP酶，从而调节诸多细胞功能，尤其是肌动蛋白细胞骨架调控、影响细胞迁移活动。DOCK8缺陷患者罹患联合免疫缺陷，但B细胞介导的抗体缺陷最为突出，其中尤以IgE水平急剧升高较为明显，目前机制未知。
　　目的:分析中国的DOCK8缺陷综合征患儿临床表现及免疫功能，采用临床样本与DOCK8-KO小鼠模型探究DOCK8蛋白缺陷对IgE水平的影响及其机制。
　　方法：采用高通量测序及流式细胞术对疑似高IgE综合征的患儿进行诊断，确立DOCK8缺陷诊断后进行淋巴细胞免疫功能评估，分析患儿及健康同龄对照外周血滤泡辅助 T细胞数量和功能改变，以及其相关功能分子 IL-21水平，实时荧光定量检测 Bcl-6及Blimp-1 mRNA表达。运用TALEN技术建立DOCK8-KO小鼠模型并对其免疫功能进行评估，分析滤泡辅助 T细胞数量功能改变，以及其相关功能分子 ICOS、PD-1、Bcl-6及 IL-21水平，对DOCK8-KO小鼠进行 IL-21替代治疗并观察其对免疫功能的修复效应。进一步构建OVA诱导哮喘DOCK8-KO小鼠模型并对其进行IL-21补充治疗，解析其治疗机制。
　　结果：
　　1.7例DOCK8免疫缺陷患儿，2男5女，高IgE综合征NIH评分均高于40分，表现为反复顽固的病毒感染，肺炎，血清 IgE异常增高和嗜酸性粒细胞增多等现象。针对DOCK8单基因的高通量测序分析显示7例患儿发生不同程度的大片段缺失突变、移码突变或错义突变，均为尚未报道过的新发突变。其中 P1患儿为19-48号外显子杂合性大片段缺失并伴有移码突变（ c.5842 delG, c5843C>A p.A1948fsX1953），P2患儿11号外显子纯合性缺失，12-33号外显子杂合性缺失，P3-4患儿为移码突变（c.3152delG p.S1051fsX1093）和错义突变（c.5175G>C p.E1725D），P5患儿为2号外显子纯合性缺失，1号，3-39号外显子杂合性缺失，P6患儿为7号外显子纯合性缺失，8-10号外显子杂合性缺失，P7患儿为移码突变（c.1278-1279 delTG p.V427fsX435）。7例患儿完成流式细胞术及Western检测，外周血单个核细胞均无DOCK8蛋白表达。患儿外周血CD4+T细胞、记忆B细胞和记忆T细胞均有不同程度降低。T细胞删除环（TRECs）、淋巴细胞增殖水平和NK细胞的细胞毒杀伤功能均明显低于正常同龄儿童。外周血调节性B细胞水平低下，而调节性T细胞，CD4+T细胞产生细胞因子IL-17、IL-4及IFN-γ水平均正常。DOCK8患儿滤泡辅助T细胞占CD4+T细胞比率与正常人相比无统计学差异，但绝对值却明显低于正常对照。尤其是Tfh细胞分泌的IL-21明显下降。
　　2.（1）运用TALEN技术建立DOCK8-KO小鼠，DOCK8-KO小鼠较 WT小鼠的血清 IgE、血液及脾脏中的 IgE＋B细胞有升高趋势，并有统计学差异。DOCK8-KO小鼠的滤泡辅助T细胞相关功能分子出现不同程度的下降，其中细胞因子IL-21水平下降极为明显，Tfh细胞分化的主要调节转录因子Bcl-6，以及Tfh细胞的功能分子PD-1、ICOS水平均不同程度降低。
　　（2）采用传统剂量四分之一的低剂量 OVA成功诱导DOCK8-KO小鼠哮喘模型，模型小鼠出现明显的肺功能异常，血清 IgE水平升高，嗜酸性粒细胞增多等过敏特征。OVA诱导的DOCK8-KO及WT小鼠IgE＋B细胞水平均有升高现象，但前者升高的水平是后者的数倍，其中血清总IgE及OVA特异性IgE水平升高尤为明显。经OVA诱导的DOCK8-KO小鼠IL-21水平随之进一步下降，而经 OVA诱导的 WT小鼠则没有明显改变。另外， OVA诱导的DOCK8-KO小鼠脾脏记忆性Tfh细胞，Tfh细胞分化的主要调节转录因子Bcl-6，以及Tfh细胞的功能分子PD-1、ICOS均出现明显降低。
　　3.（1）使用重组小鼠 IL-21细胞因子（20ng/d×3-6天）对DOCK8-KO小鼠进行替代治疗，发现KO小鼠血清IgE水平几乎能够回复到正常水平，脾脏 Tfh细胞及其分化的主要调节转录因子Bcl-6，以及Tfh细胞的功能分子PD-1和ICOS均能不同程度的回升至接近正常水平，治疗效应十分明显。
　　（2）采用IL-21治疗OVA诱导的小鼠模型，WT小鼠的IgE水平虽有回复，但总体治疗效果不如DOCK8-KO小鼠明显。经OVA诱导的DOCK8-KO小鼠经过IL-21治疗其IgE水平能够回复到正常水平，并且Tfh细胞及其主要调节转录因子Bcl-6，以及Tfh细胞的功能分子PD-1，ICOS均能不同程度的回升至正常水平。
　　结论：DOCK8缺陷引起Tfh细胞发育分化障碍，IL-21分泌降低，可能是导致B细胞对过敏原反应失控，产生大量功能性IgE的根本原因。
　　第二部分 IKKβ缺陷对 NF-κB入核的影响
　　背景：IKBKB基因突变是一种特殊的联合免疫缺陷病，以反复细菌、病毒、真菌感染为主要表现，大部分病人会出现不同程度鹅口疮、支气管炎及肺炎，并伴有慢性腹泻、生长发育迟缓、脑出血、癫痫、脐炎、脐带脱落延迟等现象。IKBKB基因定位于人类8号染色体p11.2，其编码的IKKβ蛋白是IκB kinase的亚单位之一，主要参与NF-κB通路激活过程，活化的IKK磷酸化IκBα（NF-κB的抑制剂），磷酸化的IκBα不断降解，使其对NF-κB的抑制功能减弱，后者则可以自由出入细胞核并激活参与炎症及免疫反应的各种基因。
　　目的：分析一例 IKBKB突变患儿临床表现、蛋白表达、基因突变及免疫功能。探讨395位点氨基酸磷酸化对NF-κB入核影响及通路功能的影响及机制。
　　方法：患儿男，17岁，生后2月龄开始出现反复呼吸道感染，腹泻及低体重。采用高通量测序发现基因突变，并用一代测序验证，采用流式细胞术及免疫印迹法检测IKKβ蛋白。采用流式细胞术分析淋巴细胞功能，EMSA方法检测核内NF-κB水平。制备395位点定点变异细胞系，以去除该位点磷酸化，探讨其对IKKβ蛋白稳定性的影响机制。
　　结果：高通量测序显示 IKBKB基因发生错义突变（c.1183T>C,p.Y395H），为尚未报道的新发突变。一代测序验证确认为该位点突变，流式细胞术及免疫印迹法均未能检测到 IKKβ蛋白表达。免疫功能评估中发现患儿记忆B细胞极度低下，调节性T细胞缺如，淋巴细胞增殖水平明显受损。调节性B细胞升高，而CD4+T细胞表达细胞因子IL-17、IL-4、IL-21及IFN-γ均处于正常下限，NK细胞的细胞毒杀伤功能及 TCRVβ多样性正常。患儿细胞核内NF-κB蛋白较正常人明显降低，提示基因突变导致进入细胞核的NF-κB水平减少。进一步发现395位点突变导致磷酸化位点消失后IKKβ降解速率增快，蛋白稳定性下降。
　　结论：确诊1例极为罕见的 PID病例——IKBKB缺陷，为全球范围内报道的第10例患儿。IKKβ的395位点发生的错义突变为尚未报道过的新发突变。首次阐明该位点是 IKKβ蛋白重要的磷酸化位点，由酪氨酸突变为组氨酸造成的氨基酸改变会导致磷酸化位点丢失，降解增快，从而最终影响NF-κB入核。

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

DOCK8基因突变致高 IgE综合征概述

IKBKB基因突变致联合免疫缺陷综合征概述

参考文献

第一部分： DOCK8缺陷状态下滤泡辅助 T细胞产生 IL-21调节 IgE的机制研究

前言

第一节:DOCK8免疫缺陷综合征患儿诊断及免疫功能评估、滤泡辅助 T细胞及 IL-21数量及功能研究

第二节:DOCK8-KO小鼠Tfh细胞及IL-21数量及功能研究

第三节:IL-21治疗 DOCK8-KO小鼠及 OVA诱导的过敏小鼠

讨论

参考文献

第二部分 IKKβ缺陷对 NF-κB入核的影响

前言

第一节:IKBKB基因突变致 SCID患儿诊断及免疫功能评估

第二节:IKKβ缺陷对NF-κB入核的影响

讨论

参考文献

全文总结

一． 全文小结

二．不足与改进

文献综述:IL-21及其相关疾病的研究进展

致谢

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