C-reactive protein相互作用蛋白的筛选及其影响肝癌细胞迁移侵袭机制的研究

摘要

研究背景和目的 原发性肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）目前位于全球恶性肿瘤的第六位，是所有癌症中死亡率最高的一个，约占全世界所有癌症相关死亡的1%。尽管肝癌的诊断和治疗在过去的几十年取得非常大的进展，但是HCC患者仍有较高的复发率和预后不良，这主要是由于这些癌细胞的高侵袭性和转移性所致。然而肿瘤的复发和转移的过程是非常复杂的，这个过程涉及多个基因的共同作用，这些基因通过转录、翻译以及各种修饰加工等转换为发挥功能的蛋白，这些蛋白相互联系相互激活等，最终影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭以及转移等导致肿瘤的进展。因此，需要尽快开发出更可靠的预测复发和了解肝癌转移机制的生物标志物。 CRP是穿透素家族的一个成员，也是第一个被发现的急性炎症蛋白。其主要生物功能是通过识别宿主的病原体和受损细胞的能力，通过招募补充系统和吞噬细胞来调节它们的消除。近年来研究发现，CRP在多种肿瘤中高表达，并且与肿瘤的进展、迁移侵袭转移能力以及增殖能力和抗凋亡能力密切相关。早前我们的研究发现，CRP与肝癌的临床诊断以及预后和进展有关。在前期研究中，通过同位素绝对定量（iTRAQ）联合串联质谱技术检测，酶联免疫吸附试验（Elisa）和组织免疫组化验证，证实 CRP可以作为辅助AFP诊断肝癌的一个指标，特别是对AFP阴性肝癌更具诊断价值。同时我们分析临床资料和进行细胞实验，发现CRP与肝癌的进展有密切关系。因此，本研究延续之前的研究，以CRP为研究点，探讨 CRP在肝癌进展中扮演的角色，以及 CRP相互作用蛋白在肝癌的迁移侵袭中的机制，为 CRP可能作为肝癌新治疗靶点提供理论依据。 方法 1. CRP对肝癌细胞迁移侵袭的影响 （1）肝癌组织和细胞中CRP的检测及意义 应用实时荧光定量 PCR检测20对原发性肝癌和相对的癌旁组织中CRP mRNA的表达，Western blot和免疫组化检测其中4对肝癌组织中蛋白水平的表达。进一步，实时荧光定量PCR和Western blot检测不同转移潜能肝癌细胞中CRP mRNA和蛋白水平的变化。 （2） CRP对肝癌细胞迁移侵袭的影响 CRP siRNA和CRP特异性抗体处理肝癌细胞SMMC7721和Huh7后，Transwell实验检测肝癌细胞体外迁移侵袭能力的变化。 2. CRP相互作用蛋白的筛选 （1）免疫共沉淀、iTRAQ和质谱筛选CRP相互作用蛋白 以CRP siRNA为对照组，Control siRNA为实验组处理肝癌细胞S MMC7721后，C RP抗体去沉淀 CRP蛋白和与 CRP相结合的蛋白，iTRAQ技术对蛋白样品进行标记，质谱技术鉴定目的蛋白。 （2）生物信息学分析 应用3个在线数据库（DAVID、 PANTHER和 WebGestalt）对这些候选蛋白进行聚类分析、通路分析和疾病相关分析。 （3）CRP相互作用蛋白验证 通过免疫共沉淀和western blot验证经生物信息学分析后筛选出的候选蛋白。 3. EphB3对肝癌细胞迁移侵袭的影响 （1）肝癌组织和细胞中EphB3的检测及意义 应用实时荧光定量 PCR检测20对原发性肝癌和相对的癌旁组织中EphB3 mRNA的表达，Westernblot和免疫组化检测其中4对肝癌组织中蛋白水平的表达。进一步，实时荧光定量PCR和Western blot检测不同转移潜能肝癌细胞中EphB3 mRNA和蛋白水平的变化，共聚焦实验明确Ep hB3在肝癌细胞中的亚定位。 （2）EphB3对肝癌细胞迁移侵袭的影响 EphB3 siRNA处理肝癌细胞SMMC7721和Huh7后，Transwell实验检测肝癌细胞体外迁移侵袭能力的变化。 4. CRP与 Ep hB3相互作用调控 MAPK/ERK通路 （1）CRP与EphB3之间存在相互作用 分别用 CRP和 EphB3为诱饵蛋白进行免疫共沉淀实验，经western blot验证CRP与EphB3之间的相互作用关系。 （2）EphB3与 MAPK/ERK之间的关系验证 免疫共沉淀和Western blot验证EphB3与MAPK/ERK之间的关系，共聚焦明确EphB3与MAPK和ERK蛋白共表达区域。EphB3 siRNA转染肝癌细胞后，Western blot检测MAPK/ERK通路磷酸化的变化。 （3）CRP对MAPK/ERK通路、HIF1α和MMP9的影响 对肝癌细胞分别用CRP抗体和或CRP重组蛋白处理后，Western blot检测MAPK/ERK通路、HIF1α和MMP9的变化。 5.统计学方法 应用 SPSSStatistics17.0软件进行统计分析，组间比较用 t检验以P<0.05为差异有统计学意义。 结果 1. CRP对肝癌细胞迁移侵袭的影响 （1）肝癌组织和细胞中 CRP的检测及意义 RT-PCR和Western blot检测CRP在肝癌和细胞组织中的表达，结果表明C RP在肝癌组织细胞中高表达，并且CRP与肝癌细胞的转移潜能相关。 （2）CRP对肝癌细胞迁移侵袭的影响 CRPsiRNA或CRP Ab处理肝癌细胞后，Transwell实验结果表明抑制肝癌细胞中C RP的水平，可以减弱肝癌细胞的迁移侵袭能力。 2. CRP相互作用蛋白的筛选 （1）免疫共沉淀、 iTRAQ和质谱筛选 CRP相互作用蛋白 通过免疫共沉淀、iTRAQ和质谱实验，一共鉴定出52个与CRP可能有相互作用的蛋白。 （2）生物信息学分析 通过DAVID、 PANTHER和 WebGestalt对这些蛋白进行聚类分析，结果表明这些蛋白主要位于细胞连接处、细胞成分、细胞外基质、大分子复合物、膜等；主要参与的生物学进程是细胞黏附、调节翻译、细胞骨架构成、血管生成等；主要分子生物功能是蛋白绑定、细胞黏附、细胞骨架构成、小分子激活、修饰等。KEGG通路分析，结果表明结果发现这些蛋白参与了 TRAIL信号通路、 PI3K/AKT通路、S1P1通路、膜受体通路以及 VEGF通路等。疾病相关分析，结果表明这些蛋白主要与肿瘤、应激、慢性疾病、代谢和转移等有关。 3. EphB3对肝癌细胞迁移侵袭的影响 （1）肝癌组织和细胞中EphB3的检测及意义 RT-PCR和Western blot检测EphB3在肝癌和细胞组织中的表达，结果表明Ep hB3在肝癌组织细胞中高表达，并且EphB3与 CRP在肝癌中的表达有一致性。 （2）EphB3对肝癌细胞迁移侵袭的影响 EphB3 siRNA处理肝癌细胞后，Transwell实验结果表明抑制肝癌细胞中EphB3的表达，可以减弱肝癌细胞的迁移侵袭能力。 4. CRP与 EphB3相互作用调控 MAPK/ERK通路 （1）CRP与 EphB3之间存在相互作用 分别用 CRP和 EphB3为诱饵蛋白进行免疫共沉淀实验，经westernblot验证 CRP与 EphB3之间存在相互作用。 （2）EphB3与 MAPK/ERK之间的关系验证 以EphB3为诱饵蛋白进行免疫共沉淀实验，证实EphB3能够沉淀下MAPK和ERK。共聚焦实验表明肝癌细胞中，EphB3与MAPK和ERK有共表达区域。EphB3 siRNA处理肝癌细胞后，MAPK/ERK通路的激活明显受到抑制。 （3）CRP对 MAPK/ERK通路、 HIF1α和 MMP9的影响 用CRP抗体和或CRP重组蛋白处理肝癌细胞后，Western blot检测结果表明 MAPK/ERK通路、 HIF1α和 MMP9明显发生变化。 结论 1.高水平的CRP促进肝癌的进展。 2. CRP与EphB3之间存在相互作用。 3. CRP绑定EphB3后激活MAPK/ER K通路增加肝癌细胞内HIF1α的表达诱导细胞内MMP-9表达增加，引起肝癌细胞的迁移侵袭。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一章CRP对肝癌细胞迁移侵袭的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二章CRP相互作用蛋白的筛选及其生物信息学分析

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三章EphB3对肝癌细胞迁移侵袭的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第四章CRP与EPHB3相互作用调控MAPK/ERK通路

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4.讨论

参考文献

全文总结

文献综述:Eph-Ephrin双向信号的研究进展

致谢

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