6株H9N2亚型AIV分离鉴定、全基因组分析及鹅源毒株感染与免疫特性研究

摘要

全球广泛流行的低致病性H9N2亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)可引起家禽、野鸟和部分哺乳动物感染H9N2亚型禽流感(Avian Influenza,AI)。水禽不单是AIV的天然宿主,还是候鸟与家禽间病毒传播的重要媒介。AIV基因易发生突变和重组,导致毒力、亲嗜性和抗原性发生变化,并成为其他亚型流感病毒重组基因的供体。密切跟踪本病毒的变异动态,筛选疫苗候选株,对禽流感防控及维护公共卫生安全具有重要意义。本试验自2015年10月至2017年3月在广东佛山某活禽交易市场采集的469份拭子样品中分离获得6株H9N2亚型AIV。对6株分离株病毒作全基因测序,应用生物软件分析序列,结果表明,各分离株HA和NA基因来源于BJ94亚系,6株病毒HA蛋白裂解位点附近的氨基酸序列均符合低致病性毒株特征(2株为PARSSR↓GL,4株为PSRSSR↓GL)。4株分离株HA蛋白受体结合位点出现Q226L(H3编号)的变化,存在结合人α2,6-唾液酸受体倾向性。6株分离株均出现NA茎部区域氨基酸缺失。PB2、M基因来源于G1亚系,M2蛋白出现S31N位点突变,提示存在对金刚烷胺和金刚乙胺耐药特性。PB1、PA、NP、NS基因来源于F98亚系,6株病毒NS1蛋白出现P42S位点的突变,使得病毒可颉颃宿主体内干扰素的产生。分析显示6株病毒内部基因与人类流感H7N9、H10N8、H5N6亚型的内部基因相似性较高,提示分离毒与上述人类病毒之间可能存在基因重组现象。试验对鹅源A/Goose/Guangdong/A11/2016(H9N2)(GS/A11)株的相关生物学特性进行测定,测定结果显示,鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT)为120 h,该毒株对鸡胚半数感染量(EID50)为10-8.632/0.1 mL。为了解H9N2对鹅的致病性,以106EID50剂量经静脉注射6周龄雏鹅(流感抗体阴性),攻毒显示,试验鹅无明显临床症状,但排毒检测发现可经喉气管和泄殖腔排毒。对攻毒鹅的气管进行病理组织学观察和病毒分布观察,结果表明,攻毒鹅气管黏膜结构被破坏,上皮细胞变性坏死、脱落、少量炎性细胞浸润;免疫组化可见感染鹅气管黏膜上皮细胞中有病毒阳性信号。试验为了解鹅源GS/A11株对鹅的免疫原性,将GS/A11株制成油乳灭活疫苗,对鹅作免疫试验,结果表明,在一次免疫后第2周免疫鹅开始产生抗体,在二次免疫后第4周平均抗体水平达到峰值(8.1 log2)。取毒株GS/A11制备的特异性血清和H9N2亚型AIV早期代表株A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)(SH10)血清(购买于哈尔滨维科生物技术开发公司)分别与分离的6株H9N2毒株和代表株SH10作交叉HI试验,HI交叉试验结果表明6株分离株与代表株的抗原性存在差异。本试验构建鹅源GS/A11株的HA蛋白进行原核表达系统、并优化表达条件。对获得的HA蛋白进行纯化、Western blot验证。Western Blot试验结果显示在56 k Da位置出现一条清晰的蛋白印迹,表明成功原核表达获得H9 HA蛋白,为实验室研究H9N2亚型AIV HA蛋白相关的下游试验(单克隆抗体制备、亚单位疫苗的研究、重组活载体疫苗的研究等)提供一定基础。课题研究为探究H9N2 AIV近期流行进化要点,明确其在禽流感传播与突变过程的作用及其疫苗候选株的选择提供了依据。

目录

摘要

ABSTRACT

缩略词英汉对照表

1 前言

1.1 禽流感简史与危害

1.2 禽流感病毒分子特征

1.2.1 病毒粒子结构特征

1.2.2 病毒基因组结构特征

1.3 基因组编码蛋白的结构及蛋白特性

1.3.1 RNA聚合酶复合体蛋白

1.3.2 血凝素

1.3.3 神经氨酸酶

1.3.4 核蛋白

1.3.5 基质蛋白

1.3.6 非结构蛋白

1.4 H9N2亚型禽流感

1.4.1 H9N2亚型禽流感宿主分布情况

1.4.2 H9N2亚型禽流感危害

1.4.3 我国H9N2亚型禽流感疫苗应用概况

1.5 本研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 样品来源

2.1.2 参考血清、抗原、SPF鸡胚及雏鹅

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要试剂的配制

2.1.5 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 样品的处理

2.2.2 病毒分离

2.2.3 病毒鉴定与纯化

2.2.4 毒株全基因组克隆与遗传进化分析

2.2.5 毒株GS/A11株生物学特性测定

2.2.6 毒株GS/A11鹅的感染排毒试验

2.2.7 毒株GS/A11感染鹅组织学观察与病毒分布研究

2.2.8 鹅源毒GS/A11免疫原性试验与HI交叉反应试验

2.2.9 毒株GS/A11 HA蛋白重组表达质粒的构建

2.2.10 阳性重组表达质粒的诱导表达

3 结果

3.1 6株H9亚型禽流感病毒分离鉴定结果

3.2 6株H9亚型禽流感病毒全基因RT-PCR扩增结果

3.3 全基因序列分析结果

3.3.1 HA基因序列分析结果

3.3.2 NA基因序列分析结果

3.3.3 PB2 基因序列分析结果

3.3.4 PB1 基因序列分析结果

3.3.5 PA基因序列分析结果

3.3.6 NP基因序列分析结果

3.3.7 M基因序列分析结果

3.3.8 NS基因序列分析结果

3.4 鹅源毒株GS/A11 MDT测定、EID50测定结果

3.4.1 鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT)测定结果

3.4.2 鸡胚半数感染量(EID50)测定结果

3.5 鹅攻毒试验结果

3.5.1 鹅感染排毒研究结果

3.5.2 鹅气管病理组织学观察结果

3.6 鹅源毒株GS/A11免疫原性试验及HI交叉反应试验结果

3.6.1 毒株GS/A11免疫应答试验结果

3.6.2 毒株GS/A11和毒株SH10血清HI交叉反应试验结果

3.7 GS/A11株HA蛋白原核表达载体构建结果

3.7.1 GS/A11株HA基因RT-PCR扩增结果

3.7.2 重组表达质粒pET30a-HA-A11双酶切鉴定结果

3.8 重组表达质粒PET30A-HA-A11原核系统表达结果

3.8.1 PET30a-HA(Rosetta)表达GS/A11-HA蛋白不同诱导时间表达结果

3.8.2 PET30a-HA(Rosetta)表达GS/A11-HA蛋白不同IPTG诱导浓度表达结果

3.8.3 PET30a-HA(Rosetta)表达GS/A11-HA蛋白可溶性分析结果

3.9 GS/A11-HA蛋白纯化及表达产物的WESTERN-BLOT鉴定结果

3.9.1 PET30a-HA(Rosetta)表达GS/A11-HA蛋白纯化结果

3.9.2 表达产物Western-blot鉴定结果

4 讨论

4.1 分离株全基因组序列分析

4.1.1 分离株HA和NA基因变异及其提示

4.1.2 分离株内部基因变异及其提示

4.2 分离株基因组蛋白位点变化分析

4.2.1 分离株HA和NA基因蛋白氨基酸位点变异及其提示

4.2.2 分离株内部基因蛋白氨基酸位点变化分析

4.3 GS/A11株动物感染试验结果分析

4.4 毒株GS/A11免疫原性试验及血清HI交叉反应试验分析

全文总结

参考文献

攻读学位期间发表论文

致谢