一种新phyA基因的克隆、表达及其生物活性测定

摘要

植酸酶(phytase,phyA)是催化植酸及其盐类物质水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称.它具有分解植酸盐的特殊作用,能促进单胃动物对磷的吸收;能使饲料中磷的利用率提高50％左右;同时它还能将与多种金属离子和蛋白质螯合的植酸磷降解;此外它还具有促进动物生长、保护生态环境等作用.因而在饲料、食品和医药工业以及环保等方面都具有重要的现实意义和潜在的应用价值.利用基因工程技术生产植酸酶,不仅可以大幅度提高其产量,还能按照人们的需要改变蛋白的特性,获得具有优良特性的高活性植酸酶蛋白.目前只有欧美发达国家才有商品化的重组植酸酶产品.但是商品化的植酸酶几乎都是利用酵母工程菌表达的,其生产成本较高、周期较长、工艺复杂等特点,限制了植酸酶的推广和应用.在我国,phyA基因工程应用基础研究较少,先后有学者采用定点突变、随机突变、构建新型表达系统等方法对phyA基因进行研究,但表达出的植酸酶在耐温性、耐酸性等方面效果不显著,还没有真正的商品化的重组植酸酶产品面市.

目录

文摘

英文文摘

缩略词

1绪论

1.1研究意义与背景

1.2植酸酶研究进展

1.2.1植酸酶的分类

1.2.2植酸酶的功能

1.2.3植酸酶的理化性质

1.2.4植酸酶的作用机理

1.2.5植酸酶基因研究进展

1.3基因工程表达系统的特点

1.3.1 Ecoli.表达系统

1.3.2乳酸菌表达系统

1.4研究目标与整体设计

1.4.1研究目标

1.4.2研究整体设计

1.5研究内容与技术路线

1.5.1黑曲霉菌种的选育

1.5.2phyA基因的克隆

1.5.3phyA基因的表达与产物纯化

1.5.4表达重组蛋白的鉴定

1.5.5表达产物的酶学性质

1.6本研究的创新性

1.6.1高活性产植酸酶菌株的选育

1.6.2构建phyA基因的两种新型表达载体

2 PHYA基因的克隆

2.1材料

2.1.1细胞株与质粒

2.1.2主要仪器设备

2.1.3主要试剂

2.2方法

2.2.1黑曲霉菌株的选育

2.2.2黑曲霉总DNA的提取

2.2.3phyA基因的PCR扩增

2.2.4 PCR扩增产物的酶切鉴定

2.2.5克隆质粒pMD18T-phyA的构建

2.2.6感受态细胞制备与克隆质粒的转化

2.2.7阳性克隆的筛选

2.2.8阳性克隆的鉴定

2.2.9phyA基因的序列测定及氨基酸序列分析

2.3结果

2.3.1黑曲霉菌种的选育

2.3.2phyA基因的克隆

2.3.3 PCR扩增产物的酶切鉴定

2.3.3克隆质粒pMD18T-phyA的构建及鉴定

2.3.4phyA基因测序及DNA序列分析

2.3.5phyA基因的氨基酸序列分析

2.4讨论

2.4.1黑曲霉的诱变处理

2.4.2 PCR引物设计

2.4.3克隆质粒的选择

2.4.4phyA基因的序列测定

2.4.5重组质粒在E.coli.中的转化

3 PHYA基因表达载体的构建及表达

3.1材料

3.1.1细胞株与质粒

3.1.2主要仪器设备

3.1.3主要试剂

3.2方法

3.2.1引物设计：

3.2.2 phyA基因表达质粒的构建

3.2.3phyA基因表达质粒的鉴定

3.2.4 BL21/pET30a(+)-phyA表达条件的优化：

3.2.5 phyA基因表达蛋白的纯化

3.2.6phyA基因表达蛋白的鉴定

3.2.7重组植酸酶蛋白的特性

3.3结果与分析

3.3.1 phyA基因表达质粒的构建及鉴定

3.3.2表达及表达条件的优化

3.3.3表达重组植酸酶的纯化

3.3.4表达产物的鉴定

3.3.5重组植酸酶蛋白的特性

3.4 讨论

3.4.1表达系统及表达质粒的选择

3.4.2phyA蛋白诱导表达及其影响因素

3.4.3实现表达产物纯化应该解决的问题

3.4.4重组植酸酶及其对畜牧研究的意义

4结论与展望

4.1结论

4.2展望

致 谢

参考文献

附录1硕士期间论文发表情况

附录2测序结果

独创性声明和学位论文版权使用授权书