槲皮素对柔红霉素心脏毒性的预防作用研究

摘要

背景槲皮素(Quercetin；3，3’，4’，5’，5，7-Pentahydroxyflavone，QUE)是一种黄酮类化合物，广泛分布于自然界各种植物的花、叶、果实之中，具有抗肿瘤、抗氧化清除自由基等多种生物活性。QUE能抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖，其中包括HL-60、NB4、MOLT-4、L1210等白血病细胞系。诱导肿瘤细胞发生凋亡是QUE抑制恶性肿瘤细胞增殖的作用机制之一，QUE还能逆转肿瘤细胞的多药耐药，与其他药物联合应用增强抗肿瘤作用。近年来，QUE在抗氧化清除自由基方面的作用也受到越来越多的关注。 广州医学院第一附属医院儿科血液病研究室的实验研究证实了QUE的抗肿瘤活性：QUE能抑制U937、K562、Jurkat细胞增殖，并存在剂量-效应关系和时间-效应关系；与柔红霉素(Daunorubicin，DNR)联用对抑制白血病细胞增殖有较强的协同作用；QUE单用及与DNR联用均能诱导U937、K562、Jurkat细胞凋亡，随着药物浓度升高凋亡细胞和坏死细胞比例增加，在一定浓度范围内QUE将细胞特异性地阻滞在S期，出现凋亡峰；两药联用较单用DNR组，S期细胞的比例明显减少。研究还通过小鼠动物实验初步观察到QUE对DNR所致的心肌损伤有预防保护作用。DNR能引起小鼠血清心肌酶谱显著升高，血清和心肌中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量显著增高，超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，引起心脏充血、水肿，心肌颗粒变性，灶性出血、坏死。而QUE保护组心肌酶升高程度明显降低、血清和心肌组织中MDA含量无明显增加，SOD活性不降低，心肌无明显出血灶及颗粒变性。其机理可能与清除氧自由基、抗脂质过氧化损伤有关。QUE与DNR联用可以预防DNR可能出现的心脏毒性。研究的结果提示QUE可能成为一种既能与DNR联用对白血病细胞产生协同抑制作用，又能预防DNR心脏毒性的抗白血病药物。 白血病为血液系统的恶性肿瘤，在小儿恶性肿瘤中占首位，15岁以下小儿白血病的发病率近十年来有所上升。白血病的主要治疗方法为化疗，近20年来，由于化疗方案的不断改进及新药的出现，已取得令人欣慰的化疗疗效，急性淋巴细胞白血病(ALL)5年无病生存率达70％～80％；急性非淋巴细胞白血病(ANLL)的初治完全缓解率亦可达90％以上，5年无病生存率在50％以上。DNR是经济、高效的第一代蒽环类抗生素，是小儿急性白血病化疗方案中的基本药物，也是提高ALL完全缓解率和长期生存率的一个重要药物，大多数ALL和ANLL化疗的诱导缓解、巩固和强化治疗方案均为包含DNR的联合化疗。但DNR化疗存在许多并发症，有些甚至严重影响了患儿的生存质量，其心脏毒性就是其中之一。DNR的累积剂量达到一定程度会引起心肌损害，从而明显限制了DNR的临床应用。DNR诱发心脏毒性的确切发病机制目前仍不清楚，普遍认为是DNR产生的氧自由基损伤心肌。 在作者所在的研究室以往研究工作的基础上，为了进一步研究QUE对DNR的心脏毒性的保护作用，本研究在细胞学水平和动物实验水平，在体外培养心肌细胞的离体实验中观察QUE对DNR诱导心肌细胞损伤的保护作用；在小鼠的活体实验中，观察QUE对DNR诱导小鼠心肌细胞损伤的保护作用。以期进一步证实QUE具有预防DNR心脏毒性、保护心肌的作用，进一步为QUE应用于抗白血病治疗提供实验依据。 研究目的探讨槲皮素对柔红霉素所致小鼠心脏毒性的预防保护作用及其机制。 研究方法1.体外分离培养乳鼠心肌细胞，分为空白对照组、DNR组、QUE干预组(DNR+QUE组)、QUE组，孵育24小时后，显微镜下观察心肌细胞形态学变化，流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率，检测培养介质中乳酸脱氢酶(LDH)、SOD、MDA的含量。 2.32只小鼠分3个实验组，一组为空白对照组，两组用柔红霉素15mg/kgip1次，诱导小鼠心肌损伤，其中一组用槲皮素100mg/kg/dig给药作为干预组，一组作为柔红霉素阳性对照组。观察各组小鼠的血清心肌酶谱、心肌和血清中MDA的含量及SOD活性的变化。观察心脏大体改变，并制备光镜切片和电镜切片，观察心肌形态学变化和超微结构变化。 研究结果1.DNR能破坏单层心肌细胞网，破坏心肌细胞，形成大量碎片，引起大量心肌细胞凋亡，培养介质中LDH、MDA含量增高，SOD含量下降。而QUE干预组心肌细胞破坏减少，细胞凋亡减少，培养介质中LDH、MDA含量增高不明显，SOD含量下降不明显，并有剂量-效应关系。 2.DNR能引起小鼠血清心肌酶谱显著升高，血清和心肌中MDA含量显著增高，SOD活性降低，引起心脏充血、水肿，心肌颗粒变性，灶性出血、坏死，心肌细胞肿胀，胞膜不完整，细胞器外漏，肌纤维排列紊乱，部分肌丝、肌节、闰盘溶解破坏甚至消失，胞核浓缩，线粒体肿胀，线立体嵴溶解、断裂甚至消失，部分出现空泡样变。而QUE干预组心肌酶升高程度明显降低、血清和心肌组织中MDA含量无明显增加，SOD活性不降低，心肌无明显出血灶及颗粒变性，QUE干预组心肌细胞胞膜基本完整，肌纤维基本排列整齐，偶见模糊，肌丝、肌节、闰盘完整，线立体膜及嵴较完整，较少破坏。 结论1.通过体外心肌细胞培养和小鼠动物实验证实，槲皮素对柔红霉素所致的心肌损伤有预防保护作用，存在剂量-效应关系，其机理可能与清除氧自由基、抗脂质过氧化损伤有关。槲皮素与柔红霉素联用可以预防柔红霉素可能出现的心脏毒性。 2.槲皮素可能成为一种即能与柔红霉素联用对白血病细胞产生协同抑制作用，又能预防或减轻柔红霉素心脏毒性的抗肿瘤药物。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

结论

附图

参考文献

附录一 槲皮素的研究进展与展望

附录二 在学期间发表的论文

致谢