尼古丁对大鼠气道平滑肌细胞内钙离子浓度及膜瞬时受体电位通道TRPC表达的影响

摘要

目的：
　　 COPD发病与多种因素有关，吸烟是导致COPD的最主要原因[3]，一般认为，人体吸入香烟后，烟雾中的有害物质致使肺组织内出现氧化抗氧化失衡，炎症细胞活化，蛋白酶抗蛋白酶失衡，细胞凋亡等一系列变化，最终发展成为COPD[5]。但是吸烟引起COPD的机制尚不清楚，阐述其确切机制对防治COPD意义十分重大。香烟中的主要有害成分是Nicotine，香烟进入人体最先直接接触人体的气道。本文通过实验观察Nicotine刺激大鼠气道平滑肌细胞后细胞内基础钙离子浓度的改变及平滑肌细胞膜上非选择性阳离子通道瞬时受体电位通道TRPC1和TPRC6mRNA表达水平变化，初步探讨Nicotine在COPD气道重塑发生中的可能作用机制。
　　 方法：
　　 一、大鼠气道平滑肌细胞的分离和原代培养：用显微技术分离大鼠远端气道平滑肌组织，采用酶消化法进行原代培养，运用形态学观察和平滑肌细胞α-actin免疫荧光鉴定细胞。
　　 二、Nicotine对大鼠远端气道平滑肌细胞基础钙离子浓度的影响：将实验分成5组，分别用不同浓度的Nicotine（10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml）刺激原代培养的大鼠气道平滑肌细胞，正常对照细胞不施加干预因素。分别于培养24小时及48小时后，用Incyte细胞内钙浓度检测系统观察大鼠ASMCs[Ca2+]I的变化。
　　 三、Nicotine对大鼠气道平滑肌细胞膜瞬时受体电位通道TRPC1和TPRC6mRNA表达的影响：实验取原代培养的大鼠气道平滑肌细胞，将实验分为正常对照组、分别用不同浓度Nicotine（10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml）刺激组，分别于刺激24小时和48小时后，提取细胞总RNA，进一步逆转录成cDNA，建立稳定的Realtime-PCR方法，定量分析大鼠气道平滑肌细胞膜瞬时受体电位通道TRPC1和TPRC6 mRNA在正常气道平滑肌细胞上的表达及Nicotine刺激后表达量的变化。
　　 结果：
　　 一、用改进后的酶消化法成功培养了大鼠原代ASMCs，该原代培养的大鼠ASMCs不仅表现出典型的平滑肌细胞的形态学和免疫学特征，而且具有完好的生理学功能。
　　 二、不同浓度Nicotine（20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml）刺激大鼠ASMCs24小时后，细胞内基础钙离子浓度(nM) 117.99 19.39，122.89 17.91，124.70 17.93较对照组85.8512.60明显升高，（p<0.05）；。以不同浓度Nicotine（20ng/ml，50ng/ml,100ng/ml）刺激48小时后钙离子浓度(nM)分别为：142.07 18.99，162.27 19.91，207.30 26.56，较对照组98.04 2.39明显升高，（p值<0.05）。100ng/ml尼古丁刺激大鼠ASMCs48小时组和刺激24小时组比较细胞内基础钙离子浓度明显升高（P<0.05）。
　　 三、正常大鼠ASMCs中有TRPC1、4、6mRNA的表达。Nicotine刺激能够促进TRPC1和TPRC6mRNA表达。20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml刺激大鼠ASMcs24小时或48小时后，TRPC1和TPRC6mRNA表达均增强。刺激24小时，TRPC1和TPRC6 mRNA 相对浓度(TRPC/β-actin×10-4)分别为：TRPC1：2.950.48，3.42 0.86，3.26 0.98，对照组为2.39 0.64；TRPC6：4.74 2.30，5.19 2.60，4.79 1.44，对照组为3.09 1.39。刺激48小时后相对浓度分别为：TRPC1：5.26 2.36，5.83 2.55，6.14 2.28，对照组为4.00 1.81；TRPC6：9.23 4.38，11.30 3.57（分别以50ng/ml、100ng/ml nicotine刺激后），对照组为6.02 3.50。和对照组比较，TRPC1和TPRC6 mRNA 相对浓度均显著升高，p均<0.05。100ng/ml尼古丁刺激大鼠ASMCs48小时组和刺激24小时组比较TPRC6 mRNA 相对浓度浓度明显升高（P<0.05）。
　　 结论：
　　 Nicotine可以导致大鼠气道平滑肌细胞内基础钙离子浓度增加，并上调大鼠气道平滑肌细胞膜瞬时受体电位通道TRPC1和TPRC6表达，它们之间的关系有待进一步研究。