结直肠癌组织中胸苷磷酸化酶表达及5'-DFUR联合干扰素-α治疗小鼠结肠癌肝转移模型的实验研究

摘要

胸苷磷酸化酶（TP）是嘧啶和核苷代谢过程中的关键酶，与血小板源性内皮细胞生长因子（PD-ECGF）的结构和作用相似，被认为与PD-ECGF是同一物质。TP具有血管生成活性，与肿瘤的生长、转移等有密切关系，在胃、结肠、卵巢等部位的癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，但结直肠癌组织中究竟是癌细胞还是间质细胞表达TP活性的问题，一直存在争议，关于TP的预后作用也未有一致意见。由于5-氟尿嘧啶（5-FU）的前体药物5’-脱氧氟尿苷（5’-DFUR）、卡培他滨（CAP）等须经肿瘤组织内高表达的TP选择性激活转化为5-FU而发挥细胞毒作用，所以提高肿瘤内TP的活性有增强这些前体药物抗肿瘤的作用。前期体外实验显示类巨噬细胞表达的TP可以降低5’-DFUR对结肠癌胞的半数有效量（IC50）。而多种细胞因子有上调TP表达的作用，前期的体外实验发现加入干扰素后，可以使5’-DFUR对结直肠癌细胞的IC50下降。本实验通过对结直肠癌标本以两种抗TP抗体染色，并收集部分临床资料进一步探索TP的表达以及TP与临床特征及预后问的关系；通过对小鼠结直肠癌肝转移模型应用5’-DFUR联合干扰素进行治疗，来探讨两药联合的抗肿瘤效果。 材料与方法： 实验一 1、临床标本 人结直肠癌标本53例取自广州医学院第二附属医院普外科1998年2月至2000年12月的手术标本。其中B期（Dukes分期）20例，C期22例、D期4例，未知分期7例；低分化腺癌4例、中分化腺癌37例、高分化腺癌2例，其它组织类型10例。肿瘤位于左半结肠的有11例，右半结肠19例、直肠20例、3例未知具体部位。肠息肉标本17例，腺瘤性10例，其他7例。 2、抗体和试剂盒 一抗采用小鼠抗TP单克隆抗体654-1（1：800）、小鼠抗TP单克隆抗体抗1C6-203（1：400），此2抗体由日本Roche Research Center提供。巨噬细胞标记物CD68的单克隆抗体PG-M1（1：100），购自DAKO公司（Denmark）。以小鼠非特异性抗体IgGI（1：100）（East Acres Biologicals，USA）为阴性对照。染色过程中所需的SP-2001试剂盒、二抗试剂盒、DAB试剂盒均购自美国Vector公司。 3、染色结果的判定及细胞计数方法 654-1和1C6-203抗体的阳性细胞表现为细胞核或细胞质棕黄色染色，偶尔也可见到单独细胞核黄染。CD68阳性细胞染色位于细胞膜呈铁锈色。先在低倍视野下选择5处阳性细胞最密集区，然后分别在400倍视野下（0.0625m㎡）下进行计数，然后分别计算出每种阳性细胞的x±s。 4、统计学分析 应用SPSS13.0统计分析软件包对数据进行Spearman相关及线性归分析，当P<0.05时，认为差异有统计学意义。 实验二 1、实验材料 SPF级近交系BALB/c小鼠114只，6-8周龄，雄性，体重20.23±2.13g，购自中山大学实验动物中心。BALB/c小鼠结肠腺癌细胞株（CT26），购自美国菌种保藏中心（ATCC）。5’-脱氧氟尿苷（5’-DFUR）由Roche公司日本研究中心提供；5-氟尿嘧啶（5-FU）注射液，江苏南通精华制药有限公司生产（批号：060507）；聚乙二醇干扰素α-2a，商品名：派罗欣（180μg/0.5ml），购自上海Roche公司。 2、实验方法 脾注射法制备小鼠结直肠癌肝转移模型后，将114只小鼠随机分为6组，术后第三天开始给药；①生理盐水组：腹腔注射，NS0.4ml×5天；②干扰素组：颈部皮下注射2mg干扰素×1天；③5-FU组：1mg/ml5-FU，腹腔注射0.4ml×5天；④5-FU+干扰素组：②+③方案；⑤5’-DFUR组：5mg/ml，腹腔注射0.4ml×5天；⑥5’-DFUR+干扰素组：②+⑤方案。每组于术后第10天、15天分别随机处死6只小鼠；剩余小鼠待其自然死亡，记录生存时间。观测小鼠术前、术后第1、2、3周体重；术后10天、15天处死小鼠，摘眼球法取血，送检验科测谷草、谷丙转氨酶、尿素、肌酐；取处死小鼠肝脏、脾脏称重，计数肝脏表面结节数目，测量最大结节直径，观察结节有无融合。 3、统计学分析 肝脏表面结节计数资料转化为等级资料后，用X2卡方检验比较；各组肝脏、脾脏重量、生化指标、平均体重变化比较采用单因素方差分析（ANOVA法）；生存期的比较应用秩和检验法分析。所有统计应用统计软件SPSS13.0数据包完成，当P<0.05时，认为差异有统计学意义。 结果： 实验一、 1、临床随访资料 截至2007年10月，53例结直肠癌患者中有50例完整随访结果。其中23例死亡，在死亡患者中，除2例于术后死亡，其余21例最长存活82个月，最短6个月，平均26.8个月。现生存27例患者，最长者已生存115个月。 2、免疫组织化学染色形态学表现 见到TP阳性细胞主要分布于环绕癌巢的间质细胞中，这些细胞主要是巨噬细胞。癌细胞只有5例表现为654-1和（或）1C-6203阳性。CD-68阳性巨噬细胞的分布范围及部位与TP阳性细胞几乎一致。息肉组织中，TP阳性细胞和CD-68阳性细胞也分布于间质中，但不同抗体染色的范围和部位不太一致。 3、免疫组织化学染色细胞计数分析 654-1和1C6-203阳性细胞数相关，癌组织中（r=0.661），息肉组织中（r=0.577）。在癌组织中654-1（r=0.647）和1C6-203（r=0.633）阳性细胞数分别与TAM细胞数相关，息肉组织中无相关。大肠癌组织与息肉组织TP阳性细胞数差异无统计学意义。不同的肿瘤部位（左右半结肠）、临床病理分期、分化程度、组织学分类间654-1抗体阳性细胞计数均无差异，P值分别为0.588、0.432、0.90、0.240。 4、大肠癌患者生存期（月）与654-1抗体阳性细胞计数无相关关系，r=0.540。 实验二、 1、体重变化 手术后10天，5-FU组（-1.62±0.62g）和5-FU联合干扰素-α组（-1.23±0.78g）体重减少较其它组明显，手术后15天，该两组体重改变分别与生理盐水组和5’-DFUR组比较有差异。 2、肝脾重量及生化指标的比较 术后10天，5-FU组和5-FU联合干扰素-α组的脾脏重量与生理盐水组、干扰素-α组、5’-DFUR联合干扰素-α组脾脏重量有差别，其它时间各组肝脾重量差异均无统计学意义。术后10天时肌苷（CREA）指标中5’-DFUR组（23.8±11.9umol/L）与5'-DFUR+IFN组（38.7±19.1 umol/L）差异有统计学意义，15天谷草转氨酶指标5-FU组（161.3±21.9 U/L）与NS（354.5±292.9 U/L）对照组差异有统计学意义。 4、肝脏表面结节计数及小鼠生存期比较 术后10天处死小鼠中，5-FU组与干扰素-α组、5’-DFUR联合干扰素-α组以及5-FU联合干扰素-α组与5’-DFUR联合干扰素-α组的肝脏表面结节计数差异有统计学意义，其与组间差异无统计学意义。各组生存期之间差异无统计学意义。 结论：人结直肠癌组织中表达TP阳性的细胞主要是TAM。结直肠癌组织中TP阳性细胞的数目与患者预后生存的时间无相关。5’-DFUR联合干扰素-α无明显提高抗小鼠肿瘤效果的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

前 言

研究对象与方法

实验一

实验二

结 果

实验一

实验二

讨 论

1.结直肠癌及息肉组织中TP的表达

2.TP与临床特征及预后的关系

3.TP与化疗的关系

结 论

参考文献

胸苷膦酸化酶的调节及研究进展(文献综述)

附图

致 谢