骨髓树突状细胞诱导抗原特异性调节性T细胞的实验研究

摘要

[目的]
　　 以小鼠骨髓源性树突状细胞(Bone marrow-derived DCs，BM-DCs)与异基因小鼠脾CD4+T细胞混合培养，以诱导抗原特异性调节性T细胞(regulatory Tcells，Tregs)的产生。
　　 [方法]
　　 (1)成熟树突状细胞的诱导：从小鼠双侧股骨提取骨髓细胞，在GM-CSF及IL-4协同刺激下培养，第7天收获半贴壁的骨髓未成熟树突状细胞(immatureDCs，imDCs)，imDCs于第6天用LPS诱导16小时获得成熟树突状细胞(matureDCs，mDCs)。
　　 (2)Tregs的诱导：免疫磁珠法分选BALB/C小鼠脾CD4+T细胞并分别与异基因C57BL/6小鼠及同基因BALB/C小鼠不同成熟状态的DCs混合培养以诱导Tregs的产生，5天后，以流式细胞仪检测各实验组诱导的Tregs(induced Tregs，iTregs)的CD25及FOXP3的表达。
　　 (3)不同方法诱导产生的Tregs体外淋巴细胞增殖抑制试验：以BALB/C小鼠CD4+CD25-T作为增殖反应细胞，C57BL/6小鼠的脾细胞为刺激细胞，加入不同数量的同基因或异基因DCs诱导的BALB/C小鼠Tregs作为淋巴细胞增殖抑制的效应细胞，以CFSE标记增殖反应细胞，用流式细胞仪(FCM)检测分析增殖抑制效应；并与新鲜分离的CD4+CD25+天然调节性T细胞(naturallyoccurring regulatory T cells，nTregs)的增殖抑制效应比较。
　　 [结果]
　　 (1)mDCs诱导：每只小鼠的双侧股骨可以得到2.50×106～3.50×106个DCs，在光学显微镜下观察具有典型DCs形态的细胞比例在60.0％～，90.0％，CD11C的表达率在imDCs和mDCs上基本相同，均大于80.0％，imDCs的CD86表达阳性率较mDCs低，分别为(9.90±0.99)％和(40.27±2.50)％。
　　 (2)Tregs的诱导：经异基因imDCs和mDCs的刺激，BALB/C小鼠CD4+T细胞中的FOXP3表达阳性率从(6.33±0.52)％分别提高到(24.89±2.67)％和(38.75±2.02)％(P<0.01)；经同基因imDCs和mDCs刺激，BALB/C小鼠的CD4+T细胞中的FOXP3表达阳性率从(6.33±0.52)％分别提高到(9.30±0.56)％和(9.65±0.92)％(P<0.05)。
　　 (3)不同方法诱导产生的iTregs体外淋巴细胞增殖抑制试验：抑制实验根据Tregs来源分为三组，即异基因DCs诱导的iTregs组(allo-Tregs组)、同基因DCs诱导的iTregs组(auto-Tregs组)及新鲜分离的nTregs组(nTreg组)。各组不同来源的Tregs作为增殖抑制细胞分别与CD4+CD25-增殖反应细胞以1:1、1:2、1:4比例混合培养，CFSE法检测CD4+CD25-T细胞增殖前体频率(PF)分别为(8.70±1.57)％、(11.67±1.37)％、(16.67±1.72)％；52.40±2.51、56.27±1.12、60.67±1.53及(16.47±2.11)％、(21.70±2.35)％、(28.20±2.55)％。三组间两两比较，差异具有统计学意义(p<0.01)。用CCK8法检测，上述三组的CD4+CD25-T细胞增殖指数(SI)分别是0.57±0.12、3.06±0.06、4.25±0.13；5.59±0.446、6.18±0.16、6.37±0.13及1.51±0.07、3.48±0.03、5.13±0.32。三组间两两比较，差异具有统计学意义(p<0.01)。
　　 [结论]
　　 (1)通过联合使用GM-CSF和IL-4，能从小鼠骨髓中诱导大量的imDCs，经过LPS刺激，imDCs可以被进一步诱导成熟。
　　 (2)异基因DCs诱导的CD4+CD25+Tregs的FOXP3表达水平比同基因DCs诱导的水平显著增高，可能因为CD4+T细胞对异、同基因抗原识别的差异所致。
　　 (3)新鲜分离的nTregs在混合淋巴细胞反应抑制试验中显示一定的体外淋巴细胞增殖抑制功能，异基因DCs诱导产生的Tregs对淋巴细胞的增殖抑制功能比nTregs明显增强，同基因DCs诱导产生的Tregs对淋巴细胞的增殖抑制功能比nTregs明显减弱。因此，用异基因DCs能从CD4+T细胞中诱导产生具备特异性抗原识别功能的抗原特异性Tregs。